Globalne podejście do kodowania kreskowego żywych komórek do profilowania

Koniugat przeciwciało-lek, który jest wybiórczo ukierunkowany na proliferatory ludzkich monocytów w terapii przeciwnowotworowej

As hematopoietic progenitors provide numerous blood cells, therapeutic methods concentrating on hematopoietic progenitors are probably helpful to get rid of undesirable blood cells, reminiscent of leukemic cells and immune cells inflicting illnesses. Nonetheless, because of their pluripotency, concentrating on these cells might impair the manufacturing of a number of cell lineages, resulting in critical unintended effects reminiscent of anemia and elevated susceptibility to an infection.

To reduce these unintended effects, it is very important establish monopotent progenitors that give rise to a specific cell lineage. Monocytes and monocyte-derived macrophages play vital roles within the improvement of inflammatory illnesses and tumors. Not too long ago, we recognized human monocyte-restricted progenitors, particularly, frequent monocyte progenitors and pre-monocytes, each of which categorical excessive ranges of CD64, a well known monocyte marker.

Right here, we introduce a dimeric pyrrolobenzodiazepine (dPBD)-conjugated anti-CD64 antibody (anti-CD64-dPBD) that selectively induces the apoptosis of proliferating human monocyte-restricted progenitors however not non-proliferating mature monocytes. Remedy with anti-CD64-dPBD didn’t have an effect on different sorts of hematopoietic cells together with hematopoietic stem and progenitor cells, neutrophils, lymphocytes and platelets, suggesting that its off-target results are negligible. In keeping with these findings, therapy with anti-CD64-dPBD instantly killed proliferating monocytic leukemia cells and prevented monocytic leukemia cell era from bone marrow progenitors of power myelomonocytic leukemia sufferers in a patient-derived xenograft mannequin.

Moreover, by depleting the supply of monocytes, therapy with anti-CD64-dPBD in the end eradicated tumor-associated macrophages and considerably lowered tumor measurement in humanized mice bearing stable tumors. Given the selective motion of anti-CD64-dPBD on proliferating monocyte progenitors and monocytic leukemia cells, it needs to be a promising instrument to focus on cancers and different monocyte-related inflammatory problems with minimal unintended effects on different cell lineages.

Poprawa przeciwciał przeciw sprzężonych z oligonukleotydami w multimodalnej sprzedaży komórek

Simultaneous measurement of floor proteins and gene expression inside single cells utilizing oligo-conjugated antibodies provides high-resolution snapshots of advanced cell populations. Sign from oligo-conjugated antibodies is quantified by high-throughput sequencing and is very scalable and delicate. We investigated the response of oligo-conjugated antibodies in the direction of 4 variables: focus, staining quantity, cell quantity at staining, and tissue. We discover that staining with really helpful antibody concentrations causes unnecessarily excessive background and quantity of antibody used could be drastically lowered with out lack of organic info.

Lowering staining quantity solely impacts antibodies concentrating on considerable epitopes used at low concentrations and is counteracted by lowering cell numbers. Adjusting concentrations will increase sign, lowers background, and reduces prices. Background sign can account for a significant fraction of complete sequencing and is primarily derived from antibodies used at excessive concentrations. This research offers new perception into titration response and background of oligo-conjugated antibodies and provides concrete pointers to enhance such panels.

Globalne podejście do kodowania kreskowego żywych komórek do profilowania metodą multipleksowej cytometrii masowej guzów myszy

Wraz z pojawieniem się immunologii nowotworów coraz częściej stosuje się cytometrię masową do charakteryzowania odpowiedzi na terapie przeciwnowotworowe i mikrośrodowiska nowotworu (TME). Jednym z jego najbardziej godnych uwagi zastosowań jest wydajne multipleksowanie próbek w partie poprzez przeznaczenie wielu kanałów izotopów metalu na kody kreskowe, co umożliwia niezawodne gromadzenie i analizę danych.

Kod kreskowy jest najbardziej skuteczny, gdy znaczniki są obecne we wszystkich interesujących nas komórkach. Chociaż wykazano, że CD45 jest wiarygodnym markerem kodu kreskowego wszystkich komórek odpornościowych w danej próbce, nie przedstawiono strategii wiarygodnego kodu kreskowego mysich komórek nowotworowych. W tym celu zidentyfikowaliśmy CD29 i CD98 jako markery szeroko eksprymowane przez powszechnie stosowane mysie linie komórkowe raka.

My  sprzężone  przeciwciała anty-CD29 i anty-CD98  przeciwciała  kadmu lub indu metali i zatwierdzone ich użyteczność w 10-Plex barcoding żywych komórek. Wreszcie, stworzyliśmy nowatorski system kodów kreskowych obejmujący kombinację CD29, CD98 i CD45 do multipleksowania dziesięciu guzów z podskórnych modeli guzów MC38 i KPC, jednocześnie z powodzeniem rekapitulując znany kontrast na osi PD1-PDL1 między dwoma modelami. Zdolność do kodowania kreskowego komórek nowotworowych wraz z komórkami odpornościowymi umożliwia badanie interakcji guza-układu odpornościowego w badaniach TME na myszach.

psmhs
psmhs

Różnica między stymulowanymi mitogenami limfocytami B i T w nieswoistym wiązaniu przeciwciał skoniugowanych z R-fikoerytrynąANSLATE TORIGINAL

Nieswoiste wiązanie  skoniugowanych  przeciwciał  stanowi krytyczny etap, który może znacząco wpłynąć na wyniki barwienia immunologicznego lub cytometrii przepływowej. Pod tym względem różne procedury barwienia i różne typy komórek mogą zmienić wyniki uzyskane z różnymi fluorochromami. W tym badaniu przeanalizowaliśmy niespecyficzne wiązanie R-fikoerytryny (R-PE) – skoniugowanych  przeciwciał  z mysimi limfocytami B i T stymulowanymi mitogenem. Komórki utrwalono, permeabilizowano i wybarwiono przy użyciu przeciwciał  kontrolnych dla izotypu  sprzężonych  z różnymi fluorochromami i oceniano metodą cytometrii przepływowej. Przeciwciała skoniugowane z  R-PE związane z limfocytami B stymulowanymi przez LPS, w przeciwieństwie do limfocytów T stymulowanych Con A, niezależnie od ich specyficzności. Odsetek komórek B dodatnich względem R-PE zmieniał się w zależności od zastosowanych  przeciwciał  lub zestawu do utrwalania / permeabilizacji.

Niemniej jednak  wykryto do 30% komórek R-PE +  B po barwieniu  kontrolnymi przeciwciałami izotypowymi  skoniugowanymi z R-PE . Ponadto, komórki B stymulowane przez LPS wiązały się niespecyficznie, w sposób zależny od dawki, z nieskoniugowanymi  cząsteczkami R-PE. Limfocyty T stymulowane Con A słabo wiążą R-PE tylko w wysokich stężeniach. Podobnie  przeciwciała skoniugowane  z innymi fluorochromami wykazały mniej niż 1% niespecyficznego wiązania niezależnie od producenta  przeciwciał  lub zestawy do utrwalania / permeabilizacji. Dane wykazały, że limfocyty B stymulowane LPS, w przeciwieństwie do limfocytów T stymulowanych Con A, wiążą R-PE niespecyficznie po wiązaniu formaldehydu lub paraformaldehydu. Dlatego wyniki oparte na zastosowaniu przeciwciał skoniugowanych  z R-PE  należy traktować ostrożnie.

Archaeal Connectase jest specjalną i wydajną ligazą białkową związaną z podjednostkami β proteasomuABSTRACTORIGINAL

Ligacje białek specyficznych dla sekwencji są szeroko stosowane do wytwarzania niestandardowych białek „na żądanie”. Takie chimeryczne, immobilizowane, sprzężone z fluoroforem  lub segmentowo znakowane białka są wytwarzane przy użyciu szeregu metod chemicznych, inteiny (rozszczepionej), domeny rozszczepionej lub enzymatycznej. Tam, gdzie wymagane są krótkie motywy ligacji i dobra chemoselektywność, często wybiera się enzymy ligazy, chociaż mają one szereg wad, na przykład słabą wydajność katalityczną, niską specyficzność substratową i reakcje uboczne.

Tutaj opisujemy specyficzną dla sekwencji ligazę białkową o korzystniejszych cechach. Ta ligaza, Connectaza, jest monomerycznym homologiem podjednostek proteasomu 20S w metanogennych archeonach. W eksperymentach z  wyciągiem z  komórek Methanosarcina mazei identyfikujemy fizjologiczny substrat metylotransferazy A (MtrA), kluczowego enzymu metanogenezy archeonów. Używając termoforezy w mikroskali i krystalografii rentgenowskiej, pokazujemy, że tylko krótka sekwencja około 20 reszt pochodzących z MtrA i zawierająca wysoce konserwatywny motyw KDPGA jest wymagana do tego oddziaływania o wysokim powinowactwie.

Wreszcie, w ilościowych oznaczeniach aktywności wykazaliśmy, że ten znacznik rozpoznający można zmienić, aby umożliwić ligację dwóch niepowiązanych białek. Konektaza katalizuje takie ligacje ze znacznie większą szybkością, z wyższą wydajnością, ale bez wykrywalnych reakcji ubocznych w porównaniu z enzymem odniesienia. Stanowi zatem atrakcyjne narzędzie do rozwoju nowych metod, na przykład przygotowania wybiórczo znakowanych białek do NMR, kowalencyjnego i geometrycznie zdefiniowanego wiązania białek na powierzchniach do mikroskopii krioelektronowej, czy też wytwarzania przeciwciał wielospecyficznych  .

Leave a Comment