Karbonylacja białka: unikanie pułapek w teście 2,4-dinitrofenylohydrazyny

Ołów (Pb2+) to neurotoksyczny środek środowiskowy, który zakłóca neurorozwoj, komunikację i organizację poprzez konkurowanie z sygnalizacją Ca2+. Jak okołoporodowa ekspozycja na Pb2+ wpływa na regulację genów związaną z Ca2+, pozostaje niejasna. Jednak Ca2+ aktywuje podjednostkę β-3 kanału wapniowego wrażliwego na napięcie typu L (Ca-β3), która autoreguluje pobudliwość neuronów i odgrywa rolę w przesunięciu GABA z neuroprzekaźnictwa pobudzającego do hamującego .

1. Mioty matki każdego miotu wahały się od N = 6-10 młodych na miot (M = 8, SD = 2), niezależnie od leczenia Pb2+, z przewagą samców nad samicami. Ponieważ w każdym z miotów było więcej samców niż samic, aby jak najlepiej ocenić i jednakowo kontrolować wpływ Pb2+- i miotu we wszystkich badanych punktach czasowych rozwoju, samice wykluczono ze względu na niewystarczającą dostępność wielkości próby z uzyskanego miotu. .
2. Z włączonych miotów, w niniejszym badaniu wykorzystano 24 eksperymentalnie naiwne samce szczurów rasy Long Evans z kapturem (kontrola N = 12; Pb2+ N = 12). Mózgi wyekstrahowano z kory przedczołowej szczura (PFC) i hipokampu (HP) w dniu poporodowym (PND) 2, 7, 14 i 22, homogenizowano w 1 ml odczynnika TRIzol na 100 mg tkanki przy użyciu homogenizatora ze szkła teflonowego.
3. Po odwirowaniu RNA wyekstrahowano chloroformem i wytrącono alkoholem izopropylowym. Próbki RNA następnie ponownie zawieszono w 100 µl H2O traktowanej DEPC. Następnie 10 μg całkowitego RNA potraktowano DNazą wolną od RNaz (  Qiagen  ) w 37°C przez 1 godzinę i ponownie oczyszczono przez ekstrakcję 3:1 fenol/chloroform, a następnie wytrącanie etanolem.
4. Z oczyszczonego RNA, 1 μg zastosowano w zestawie SYBR GreenER Two-Step qRT-PCR  (  Invitrogen) do syntezy pierwszej nici cDNA i ilościowej reakcji PCR w czasie rzeczywistym (qRT-PCR). Wpływ okołoporodowej ekspozycji na Pb2+ na geny związane z wczesnym rozwojem neuronalnym i przesunięciem GABA oceniano poprzez ekspresję izoform Ca-β3, GABAAR-β3, NKCC1, KCC2 i GAD 80, 86, 65 i 67.

Okrągłe RNA (circRNA) biorą udział w rozwoju i progresji kardiomiopatii cukrzycowej (DCM). Jednak konkretna funkcja i mechanizm leżący u podstaw circ_0071269 w DCM pozostają niejasne. W naszym badaniu ekspresję mRNA i miRNA  wykrywano  metodą ilościowej PCR w czasie rzeczywistym (qRT-PCR). W celu zbadania charakterystyki circ_0071269 zastosowano traktowanie RNazą  R i aktynomycyną D.  W celu określenia żywotności komórek, zawartości LDH w komórkach oraz poziomu interleukiny (IL)-1β i IL-18 przeprowadzono test Cell Counting Kit -8 (CCK-8), zestawy do dehydrogenazy mleczanowej (LDH) i ELISA  , odpowiednio. 

Śmiertelność komórek określono za pomocą cytometrii przepływowej, a Western blot dotyczył poziomów ekspresji białka. Ponadto przeprowadzono testy reporterowe lucyferazy i testy pull-down RNA w celu potwierdzenia związku wiązania między miR-145 i circ_0071269 lub gasderminą A (GSDMA). W celu oceny uszkodzenia mięśnia sercowego in vivo przeprowadzono echokardiografię, barwienie hematoksyliną i eozyną (HE) oraz barwienie immunohistochemiczne (IHC)  .

Odkryliśmy, że circ_0071269 ulegał znacznej nadekspresji w komórkach H9c2 po potraktowaniu wysokim poziomem glukozy. Powalenie circ_0071269 promowało żywotność komórek i hamowało odpowiedź zapalną, cytotoksyczność i piroptozę komórek H9c2  in vitro . Co więcej, circ_0071269 gąbki miR-145 w celu zwiększenia GSDMA. Inhibitor miR-145 antagonizował wpływ knockdown circ_0071269 na funkcje komórkowe komórek H9c2, podczas gdy wpływ miR-145 został zniesiony przez nadekspresję GSDMA . Tymczasem knockdown circ_0071269 osłabił dysfunkcję serca u myszy DM. W związku z tym circ_0071269 może promować rozwój DCM poprzez oś miR-145/GSDMA, a tym samym zapewnić nowy marker do leczenia DCM.

Zawał mięśnia sercowego (MI) to rodzaj choroby sercowo-naczyniowej spowodowanej martwicą mięśnia sercowego. Coraz więcej dowodów sugeruje, że okrągłe RNA (circRNA) odgrywają kluczową rolę w uszkodzeniu MI wywołanym niedotlenieniem/reoksygenacją serca (H/R).

Ustalono model niedotlenienia/reoksygenacji komórek H9C2 i wykryto ekspresję około 0001206  za  pomocą ilościowej reakcji łańcuchowej polimerazy w czasie rzeczywistym. Testy rybonukleazy R ( RNazy  R) i aktynomycyny D (Akt D) potwierdziły stabilność. Zestaw do liczenia komórek  -8 (CCK-8), testy western blot, TUNEL i cytometria przepływowa oceniały żywotność komórek i apoptozę komórek. Obniżanie RNA, immunoprecypitacja białek wiążących RNA (RIP) i testy reporterowe lucyferazy badały mechanizmy leżące u podstaw MI. Wszystkie dane eksperymentalne zostały przedstawione ze średnią ± odchylenie standardowe (SD) i P < 0,05 wskazywały na istotność statystyczną. Circ_0001206 miał niską ekspresję w komórkach H9C2 poddanych działaniu H/R. Circ_0001206 powstał w wyniku cyklizacji CRK, takiego jak protoonkogen, białko adaptacyjne (CRKL). Nadekspresja Circ_0001206 promowała żywotność komórek i hamowała apoptozę kardiomiocytów. Potwierdzono, że circ_0001206 reguluje ekspresję CRKL poprzez działanie jako konkurujący endogenny RNA (ceRNA) mikroRNA-665 (miR-665). CRKL odegrał ochronną rolę w MI.