Karbonylacja białka: unikanie pułapek w teście 2,4-dinitrofenylohydrazyny

Zawartość karbonylków białka jest szeroko stosowana zarówno jako marker stresu oksydacyjnego, jak i miara uszkodzeń oksydacyjnych. Szeroko stosowane metody oznaczania karbonylowania białek wykorzystują reakcję grup karbonylowych z 2,4-dinitrofenylohydrazyną (DNPH) w celu wytworzenia związanych z białkami 2,4-dinitrofenylohydrazonu. Hydrazony można oznaczać ilościowo spektrofotometrycznie lub, dla większej czułości,  wykrywać  immunochemicznie za pomocą przeciwciał przeciwko dinitrofenylowi. Zwrócenie uwagi na metodologię jest ważne, aby uniknąć artefaktycznego podwyższenia wyników pomiarów karbonylków białek. Przebadaliśmy ekstrakty Escherichia coli, aby zidentyfikować i wyeliminować takie efekty. Zanieczyszczenie kwasem nukleinowym spowodowało poważny, artefaktyczny wzrost zawartości karbonylków białka oznaczanej technikami spektrofotometrycznymi.
Zarówno zsyntetyzowane in vitro oligonukleotydy DNA, jak i oczyszczony chromosomalny DNA silnie reagowały z 2,4-DNPH. Traktowanie ekstraktów komórkowych  DNazą + RNazą  lub siarczanem streptomycyny w celu wytrącenia kwasów nukleinowych dramatycznie zmniejszyło widoczny karbonyl, podczas gdy ekspozycja na proteinazę K nie.
Komercyjny  zestaw  do immunochemicznego  wykrywania  karbonylowania białek (OxyBlot firmy Chemicon/Millipore) zaleca wysokie stężenie tiolu w buforze homogenizującym. Odkryliśmy, że to zalecenie prowadzi do sztucznego podwojenia karbonylku białka, być może z powodu stymulowanej tiolem reakcji Fentona. Unikanie warunków utleniających, usuwanie kwasów nukleinowych i szybkie oznaczanie próbek może zapobiec artefaktowym wpływom na pomiary karbonylków białek.

Okołoporodowa ekspozycja na Pb2+ zmienia ekspresję genów związanych z neurorozwojowym przesunięciem GABA u szczurów po urodzeniu

Ołów (Pb2+) to neurotoksyczny środek środowiskowy, który zakłóca neurorozwoj, komunikację i organizację poprzez konkurowanie z sygnalizacją Ca2+. Jak okołoporodowa ekspozycja na Pb2+ wpływa na regulację genów związaną z Ca2+, pozostaje niejasna. Jednak Ca2+ aktywuje podjednostkę β-3 kanału wapniowego wrażliwego na napięcie typu L (Ca-β3), która autoreguluje pobudliwość neuronów i odgrywa rolę w przesunięciu GABA z neuroprzekaźnictwa pobudzającego do hamującego .
W sumie osiem samic (n = 4 kontrolne i n = 4 okołoporodowe) i cztery samce (n = 2 kontrolne i n = 2 okołoporodowe) szczurów wykorzystano jako hodowców, aby służyły jako matki i ojcowie.
  1. Mioty matki każdego miotu wahały się od N = 6-10 młodych na miot (M = 8, SD = 2), niezależnie od leczenia Pb2+, z przewagą samców nad samicami. Ponieważ w każdym z miotów było więcej samców niż samic, aby jak najlepiej ocenić i jednakowo kontrolować wpływ Pb2+- i miotu we wszystkich badanych punktach czasowych rozwoju, samice wykluczono ze względu na niewystarczającą dostępność wielkości próby z uzyskanego miotu. .
  2. Z włączonych miotów, w niniejszym badaniu wykorzystano 24 eksperymentalnie naiwne samce szczurów rasy Long Evans z kapturem (kontrola N = 12; Pb2+ N = 12). Mózgi wyekstrahowano z kory przedczołowej szczura (PFC) i hipokampu (HP) w dniu poporodowym (PND) 2, 7, 14 i 22, homogenizowano w 1 ml odczynnika TRIzol na 100 mg tkanki przy użyciu homogenizatora ze szkła teflonowego.
  3. Po odwirowaniu RNA wyekstrahowano chloroformem i wytrącono alkoholem izopropylowym. Próbki RNA następnie ponownie zawieszono w 100 µl H2O traktowanej DEPC. Następnie 10 μg całkowitego RNA potraktowano DNazą wolną od RNaz (  Qiagen  ) w 37°C przez 1 godzinę i ponownie oczyszczono przez ekstrakcję 3:1 fenol/chloroform, a następnie wytrącanie etanolem.
  4. Z oczyszczonego RNA, 1 μg zastosowano w zestawie SYBR GreenER Two-Step qRT-PCR  (  Invitrogen) do syntezy pierwszej nici cDNA i ilościowej reakcji PCR w czasie rzeczywistym (qRT-PCR). Wpływ okołoporodowej ekspozycji na Pb2+ na geny związane z wczesnym rozwojem neuronalnym i przesunięciem GABA oceniano poprzez ekspresję izoform Ca-β3, GABAAR-β3, NKCC1, KCC2 i GAD 80, 86, 65 i 67.
RNase+DNase detection kit
RNase+DNase detection kit

CircularRNA circ_0071269 knockdown chroni przed uszkodzeniem kardiomiopatii cukrzycowej przez oś microRNA-145/gasdermina A

Okrągłe RNA (circRNA) biorą udział w rozwoju i progresji kardiomiopatii cukrzycowej (DCM). Jednak konkretna funkcja i mechanizm leżący u podstaw circ_0071269 w DCM pozostają niejasne. W naszym badaniu ekspresję mRNA i miRNA  wykrywano  metodą ilościowej PCR w czasie rzeczywistym (qRT-PCR). W celu zbadania charakterystyki circ_0071269 zastosowano traktowanie RNazą  R i aktynomycyną D.  W celu określenia żywotności komórek, zawartości LDH w komórkach oraz poziomu interleukiny (IL)-1β i IL-18 przeprowadzono test Cell Counting Kit -8 (CCK-8), zestawy do dehydrogenazy mleczanowej (LDH) i ELISA  , odpowiednio. 
Śmiertelność komórek określono za pomocą cytometrii przepływowej, a Western blot dotyczył poziomów ekspresji białka. Ponadto przeprowadzono testy reporterowe lucyferazy i testy pull-down RNA w celu potwierdzenia związku wiązania między miR-145 i circ_0071269 lub gasderminą A (GSDMA). W celu oceny uszkodzenia mięśnia sercowego in vivo przeprowadzono echokardiografię, barwienie hematoksyliną i eozyną (HE) oraz barwienie immunohistochemiczne (IHC)  .
Odkryliśmy, że circ_0071269 ulegał znacznej nadekspresji w komórkach H9c2 po potraktowaniu wysokim poziomem glukozy. Powalenie circ_0071269 promowało żywotność komórek i hamowało odpowiedź zapalną, cytotoksyczność i piroptozę komórek H9c2  in vitro . Co więcej, circ_0071269 gąbki miR-145 w celu zwiększenia GSDMA. Inhibitor miR-145 antagonizował wpływ knockdown circ_0071269 na funkcje komórkowe komórek H9c2, podczas gdy wpływ miR-145 został zniesiony przez nadekspresję GSDMA . Tymczasem knockdown circ_0071269 osłabił dysfunkcję serca u myszy DM. W związku z tym circ_0071269 może promować rozwój DCM poprzez oś miR-145/GSDMA, a tym samym zapewnić nowy marker do leczenia DCM.

Circ_0001206 reguluje oś miR-665/CRKL, aby złagodzić uszkodzenie kardiomiocytów wywołane niedotlenieniem/reoksygenacją w zawale mięśnia sercowego

Zawał mięśnia sercowego (MI) to rodzaj choroby sercowo-naczyniowej spowodowanej martwicą mięśnia sercowego. Coraz więcej dowodów sugeruje, że okrągłe RNA (circRNA) odgrywają kluczową rolę w uszkodzeniu MI wywołanym niedotlenieniem/reoksygenacją serca (H/R).
Ustalono model niedotlenienia/reoksygenacji komórek H9C2 i wykryto ekspresję około 0001206  za  pomocą ilościowej reakcji łańcuchowej polimerazy w czasie rzeczywistym. Testy rybonukleazy R ( RNazy  R) i aktynomycyny D (Akt D) potwierdziły stabilność. Zestaw do liczenia komórek  -8 (CCK-8), testy western blot, TUNEL i cytometria przepływowa oceniały żywotność komórek i apoptozę komórek. Obniżanie RNA, immunoprecypitacja białek wiążących RNA (RIP) i testy reporterowe lucyferazy badały mechanizmy leżące u podstaw MI. Wszystkie dane eksperymentalne zostały przedstawione ze średnią ± odchylenie standardowe (SD) i P < 0,05 wskazywały na istotność statystyczną. Circ_0001206 miał niską ekspresję w komórkach H9C2 poddanych działaniu H/R. Circ_0001206 powstał w wyniku cyklizacji CRK, takiego jak protoonkogen, białko adaptacyjne (CRKL). Nadekspresja Circ_0001206 promowała żywotność komórek i hamowała apoptozę kardiomiocytów. Potwierdzono, że circ_0001206 reguluje ekspresję CRKL poprzez działanie jako konkurujący endogenny RNA (ceRNA) mikroRNA-665 (miR-665). CRKL odegrał ochronną rolę w MI.

Okrągły RNA circ_0000644 promuje progresję raka brodawkowatego tarczycy poprzez gąbkę miR-1205 i regulację ekspresji E2F3

Rozregulowanie kolistych RNA (circRNA) ułatwia nowotworzenie raka brodawkowatego tarczycy (PTC). Celem tego badania było określenie funkcji i mechanizmu circ_0000644 w regulowaniu rozwoju PTC. Ekspresje Circ_0000644, microRNA-1205 (miR-1205) i E2F czynnika transkrypcyjnego 3 (E2F3)  wykryto  za pomocą ilościowej reakcji łańcuchowej polimerazy w czasie rzeczywistym (qRT-PCR). Testy z aktynomycyną D (ActD) i rybonukleazą R ( RNaza  R) zastosowano do weryfikacji kołowej charakterystyki circ_0000644. Po stłumieniu circ_0000644 wzrost komórek PTC, migrację, inwazję i apoptozę oceniano odpowiednio za pomocą  zestawu do liczenia komórek -8 (CCK-8), testu Transwell i analizy cytometrii przepływowej.

PI/RNAse

PI/RNASE ImmunoStep 200 test 208.2 EUR

DNase (RNase-free)

abx098138-1500U Abbexa 1500 U 543.6 EUR

DNASE I, RNASE FREE

DD0649 Bio Basic 50KU 537.64 EUR

RNase-Free DNase Set

BS88253 Bio Basic 50preps 175.1 EUR

Fungi/ Yeast Genomic DNA Extraction Mini Kit(50prep)- RNase A

FAFYG001-RNASE Favorgen 50 preps 363.6 EUR

PCR Mycoplasma Detection Kit

M034-Kit TOKU-E Kit 319.2 EUR

Agarose Tablets , DNase/RNase Free

BIO-41027 Bioline 300g Ask for price

DNase I (not RNase FREE)

DD0099 Bio Basic 250mg 117.42 EUR

Fungi/ Yeast Genomic DNA Extraction Mini Kit(100prep)- RNase A

FAFYG001-1-RNASE Favorgen 100 preps 537.6 EUR

Sterile DNase/RNase-free Filtered Pipette Tip

AI10R5 Abclonal 10μL Ask for price

Sterile DNase/RNase-free Universal Pipette Tip

AI200R1 Abclonal 200μL Ask for price

Sterile DNase/RNase-free Filtered Pipette Tip

AI200R3 Abclonal 200μL Ask for price

Sterile DNase/RNase-free Filtered Pipette Tip

AI20R1 Abclonal 20μL Ask for price

EZ Q2 (DNASE, RNASE-Be-Gone) Solution

RT4201 Bio Basic 50ml 138.3 EUR

RNase Activity Detection/Quantification Assay Kit (Fluorometric)

K934-100 Biovision 574.8 EUR

.5mL Pestles DNase RNase + pyrogen free Ind. Wrap

ARG1530 Scientific Laboratory Supplies PK100 177.84 EUR

0.5 ml Pestle+Microtube DNase RNase + pyrogen free

ARG1540 Scientific Laboratory Supplies PK100 215.46 EUR

Sterile DNase/RNase-free Low Retention Filtered Pipette Tip

AI1000R7 Abclonal 1000μL Ask for price

Sterile DNase/RNase-free Low Retention Filtered Pipette Tip

AI100R2 Abclonal 100μL Ask for price

Sterile DNase/RNase-free Low Retention Filtered Pipette Tip

AI10R7 Abclonal 10μL Ask for price

Sterile DNase/RNase-free Low Retention Filtered Pipette Tip

AI200R4 Abclonal 200μL Ask for price

Sterile DNase/RNase-free Low Retention Filtered Pipette Tip

AI20R2 Abclonal 20μL Ask for price

Water, Ultra Pure, Free of DNase, RNase, Protease, Endonuclease

WW1002 Bio Basic 100ml 67.31 EUR

Sterile DNase/RNase-free Long Low Retention Filtered Pipette Tip

AI10R8 Abclonal 10μL Ask for price

Nunc White Rayon adhesive sealing tape RNase and DNase free

241205 Scientific Laboratory Supplies PK50 204.06 EUR

15 mL ClearLine microtubes with snap cap RNase DNase free

DD390690 Scientific Laboratory Supplies PK1000 22.8 EUR

2 mL ClearLine microtubes with snap cap RNase DNase free

DD390692 Scientific Laboratory Supplies PK1000 26.22 EUR

Coloured pestle (assorted colours) microtube 1.5 mL RNase and DNase free

DD45422 Scientific Laboratory Supplies PK10 25.08 EUR

Eppendorf tubes 5mL amber sterile pyrogen DNase RNase and DNA free

E0030122330 Scientific Laboratory Supplies PK200 72.96 EUR

DNase-I/ Rat DNase- I ELISA Kit

ELA-E1127r Lifescience Market 96 Tests 1063.2 EUR

SLS Select Sterile Skirted Centrifuge Tube DNase and RNase free 50ml Sterile Bagged

SLS8114 Scientific Laboratory Supplies PK500 291.84 EUR

Porcine RNase ELISA Kit

EPR0364 Abclonal 96Tests 625.2 EUR

Rabbit RNase ELISA Kit

ERTR0364 Abclonal 96Tests 625.2 EUR

Rat RNase ELISA Kit

ERR0364 Abclonal 96Tests 625.2 EUR

Goat RNase ELISA Kit

EGTR0364 Abclonal 96Tests 625.2 EUR

Monkey RNase ELISA Kit

EMKR0364 Abclonal 96Tests 625.2 EUR

Mouse RNase ELISA Kit

EMR0364 Abclonal 96Tests 625.2 EUR

Human RNase ELISA Kit

EHR0364 Abclonal 96Tests 625.2 EUR

RNASE ELISA KIT|Human

EF007146 Lifescience Market 96 Tests 826.8 EUR

Bovine RNase ELISA Kit

EBR0364 Abclonal 96Tests 625.2 EUR

Chicken RNase ELISA Kit

ECKR0364 Abclonal 96Tests 625.2 EUR

Anserini RNASE ELISA Kit

EAR0364 Abclonal 96Tests 625.2 EUR

Canine RNase ELISA Kit

ECR0364 Abclonal 96Tests 625.2 EUR

Sheep RNase ELISA Kit

ESR0364 Abclonal 96Tests 625.2 EUR

RNase A

abx098139-1ml Abbexa 1 ml 260.4 EUR

PI / RNAse

abx290029-200tests Abbexa 200 tests 326.4 EUR

RNase A

M1227-25 Biovision 294 EUR

RNase R

M1228-500 Biovision 438 EUR

RNase A

RB0473 Bio Basic 500mg 219.73 EUR

RNase A

RN103-001 GenDepot 300mg 3138 EUR

DNase I

DN102-001 GenDepot 100mg 1729.2 EUR

DNase I

M1230-2000 Biovision 346.8 EUR

DNase Medium

MED1196 Scientific Laboratory Supplies PK10 7.98 EUR

DNase Agar

MED1392 Scientific Laboratory Supplies EACH 124.26 EUR

Human Ribonuclease (RNASE) ELISA Kit

abx253109-96tests Abbexa 96 tests 848.4 EUR

Chicken Ribonuclease (RNASE) ELISA Kit

abx354731-96tests Abbexa 96 tests 990 EUR

Monkey Ribonuclease (RNASE) ELISA Kit

abx355046-96tests Abbexa 96 tests 990 EUR

Pig Ribonuclease (RNASE) ELISA Kit

abx355190-96tests Abbexa 96 tests 990 EUR

Rabbit Ribonuclease (RNASE) ELISA Kit

abx355297-96tests Abbexa 96 tests 990 EUR

Human Ribonuclease,RNASE ELISA Kit

201-12-0767 SunredBio 96 tests 528 EUR

Human Ribonuclease,RNASE ELISA Kit

CN-04532H1 ChemNorm 96T 536.4 EUR

Human Ribonuclease,RNASE ELISA Kit

CN-04532H2 ChemNorm 48T 355.2 EUR

Human RNASE(Ribonuclease) ELISA Kit

EH3719 FN Test 96T 628.92 EUR

Guinea Pig RNase ELISA Kit

EGR0364 Abclonal 96Tests 625.2 EUR

Human Ribonuclease(RNASE)ELISA Kit

GA-E0783HM-48T GenAsia Biotech 48T 346.8 EUR

Human Ribonuclease(RNASE)ELISA Kit

GA-E0783HM-96T GenAsia Biotech 96T 559.2 EUR

Human Ribonuclease(RNASE)ELISA Kit

QY-E03180 Qayee Biotechnology 96T 433.2 EUR

PCR plate 96-well non-skirted Standard clear 50 pcs. PP DNase-/RNase- DNA-free

781368 Scientific Laboratory Supplies PK50 236.09 EUR

PCR plate 96-well semi-skirted Standard clear 50 pcs. PP DNase-/RNase- DNA-free

781375 Scientific Laboratory Supplies PK50 236.09 EUR

Frit Kit

FRIT-KIT Next Advance 1each 148.8 EUR

Human deoxyribonuclease ?,DNase-? ELISA Kit

201-12-0877 SunredBio 96 tests 528 EUR

Porcine Dnase I ELISA Kit

EPD0221 Abclonal 96Tests 625.2 EUR

Porcine Dnase-I ELISA Kit

EPD0253 Abclonal 96Tests 625.2 EUR

Rabbit Dnase I ELISA Kit

ERTD0221 Abclonal 96Tests 625.2 EUR

Rabbit Dnase-I ELISA Kit

ERTD0253 Abclonal 96Tests 625.2 EUR

Rat Dnase I ELISA Kit

ERD0221 Abclonal 96Tests 625.2 EUR

Rat Dnase-I ELISA Kit

ERD0253 Abclonal 96Tests 625.2 EUR

Mouse Dnase I ELISA Kit

EMD0221 Abclonal 96Tests 625.2 EUR

Mouse Dnase-I ELISA Kit

EMD0253 Abclonal 96Tests 625.2 EUR

Monkey Dnase I ELISA Kit

EMKD0221 Abclonal 96Tests 625.2 EUR

Human Dnase I ELISA Kit

EHD0221 Abclonal 96Tests 625.2 EUR

Human Dnase-I ELISA Kit

EHD0253 Abclonal 96Tests 625.2 EUR

Goat Dnase I ELISA Kit

EGTD0221 Abclonal 96Tests 625.2 EUR

Goat Dnase-I ELISA Kit

EGTD0253 Abclonal 96Tests 625.2 EUR

Bovine Dnase I ELISA Kit

EBD0221 Abclonal 96Tests 625.2 EUR

Bovine Dnase-I ELISA Kit

EBD0253 Abclonal 96Tests 625.2 EUR

Canine Dnase I ELISA Kit

ECD0221 Abclonal 96Tests 625.2 EUR

Canine Dnase-I ELISA Kit

ECD0253 Abclonal 96Tests 625.2 EUR

Chicken Dnase I ELISA Kit

ECKD0221 Abclonal 96Tests 625.2 EUR

Anserini Dnase-I ELISA Kit

EAD0253 Abclonal 96Tests 625.2 EUR

Sheep Dnase I ELISA Kit

ESD0221 Abclonal 96Tests 625.2 EUR

Human Deoxyribonuclease (DNASE) ELISA Kit

QY-E05532 Qayee Biotechnology 96T 433.2 EUR

RNAse H2A Antibody

4979-002mg ProSci 0.02 mg 206.18 EUR

RNAse H2A Antibody

4979-01mg ProSci 0.1 mg 523.7 EUR

RNAse H2A Peptide

4979P ProSci 0.05 mg 197.7 EUR

Rnase (90–105)

5-01885 CHI Scientific 4 x 1mg Ask for price

RNase L Peptide

46-735P ProSci 0.1 mg 405.6 EUR

RNase A (MBG)

409-050 GeneOn 50 mg 87.6 EUR

RNase A (MBG)

409-250 GeneOn 250 mg 231.6 EUR

RNAse H2A Antibody

24819-100ul SAB 100ul 468 EUR
Zależności regulacyjne między circ_0000644, E2F3 i miR-1205 potwierdzono w teście immunoprecypitacji RNA (RIP) i teście reporterowym z podwójną lucyferazą. Poza tym wpływy regulacyjne circ_0000644 na poziom białka E2F3 analizowano metodą Western blot. W PTC circ_0000644 wykazywał wysoką ekspresję i był zlokalizowany głównie w cytoplazmie i miał stabilną strukturę. Uderzenie circ_0000644 zahamowało wzrost, migrację i inwazję komórek PTC oraz ułatwiło apoptozę. Circ_0000644 mógł bezpośrednio oddziaływać z miR-1205 w celu zahamowania ekspresji miR-1205 i służył jako gąbka miR-1205 do modulowania ekspresji E2F3 w komórkach PTC. Circ_0000644 zwiększa ekspresję E2F3 przez gąbkowanie miR-1205 w celu promowania progresji PTC.

Dodaj komentarz