Karbonylacja białka: unikanie pułapek w teście 2,4-dinitrofenylohydrazyny

Zawartość karbonylków białka jest szeroko stosowana zarówno jako marker stresu oksydacyjnego, jak i miara uszkodzeń oksydacyjnych. Szeroko stosowane metody oznaczania karbonylowania białek wykorzystują reakcję grup karbonylowych z 2,4-dinitrofenylohydrazyną (DNPH) w celu wytworzenia związanych z białkami 2,4-dinitrofenylohydrazonu. Hydrazony można oznaczać ilościowo spektrofotometrycznie lub, dla większej czułości,  wykrywać  immunochemicznie za pomocą przeciwciał przeciwko dinitrofenylowi. Zwrócenie uwagi na metodologię jest ważne, aby uniknąć artefaktycznego podwyższenia wyników pomiarów karbonylków białek. Przebadaliśmy ekstrakty Escherichia coli, aby zidentyfikować i wyeliminować takie efekty. Zanieczyszczenie kwasem nukleinowym spowodowało poważny, artefaktyczny wzrost zawartości karbonylków białka oznaczanej technikami spektrofotometrycznymi.
Zarówno zsyntetyzowane in vitro oligonukleotydy DNA, jak i oczyszczony chromosomalny DNA silnie reagowały z 2,4-DNPH. Traktowanie ekstraktów komórkowych  DNazą + RNazą  lub siarczanem streptomycyny w celu wytrącenia kwasów nukleinowych dramatycznie zmniejszyło widoczny karbonyl, podczas gdy ekspozycja na proteinazę K nie.
Komercyjny  zestaw  do immunochemicznego  wykrywania  karbonylowania białek (OxyBlot firmy Chemicon/Millipore) zaleca wysokie stężenie tiolu w buforze homogenizującym. Odkryliśmy, że to zalecenie prowadzi do sztucznego podwojenia karbonylku białka, być może z powodu stymulowanej tiolem reakcji Fentona. Unikanie warunków utleniających, usuwanie kwasów nukleinowych i szybkie oznaczanie próbek może zapobiec artefaktowym wpływom na pomiary karbonylków białek.

Okołoporodowa ekspozycja na Pb2+ zmienia ekspresję genów związanych z neurorozwojowym przesunięciem GABA u szczurów po urodzeniu

Ołów (Pb2+) to neurotoksyczny środek środowiskowy, który zakłóca neurorozwoj, komunikację i organizację poprzez konkurowanie z sygnalizacją Ca2+. Jak okołoporodowa ekspozycja na Pb2+ wpływa na regulację genów związaną z Ca2+, pozostaje niejasna. Jednak Ca2+ aktywuje podjednostkę β-3 kanału wapniowego wrażliwego na napięcie typu L (Ca-β3), która autoreguluje pobudliwość neuronów i odgrywa rolę w przesunięciu GABA z neuroprzekaźnictwa pobudzającego do hamującego .
W sumie osiem samic (n = 4 kontrolne i n = 4 okołoporodowe) i cztery samce (n = 2 kontrolne i n = 2 okołoporodowe) szczurów wykorzystano jako hodowców, aby służyły jako matki i ojcowie.
  1. Mioty matki każdego miotu wahały się od N = 6-10 młodych na miot (M = 8, SD = 2), niezależnie od leczenia Pb2+, z przewagą samców nad samicami. Ponieważ w każdym z miotów było więcej samców niż samic, aby jak najlepiej ocenić i jednakowo kontrolować wpływ Pb2+- i miotu we wszystkich badanych punktach czasowych rozwoju, samice wykluczono ze względu na niewystarczającą dostępność wielkości próby z uzyskanego miotu. .
  2. Z włączonych miotów, w niniejszym badaniu wykorzystano 24 eksperymentalnie naiwne samce szczurów rasy Long Evans z kapturem (kontrola N = 12; Pb2+ N = 12). Mózgi wyekstrahowano z kory przedczołowej szczura (PFC) i hipokampu (HP) w dniu poporodowym (PND) 2, 7, 14 i 22, homogenizowano w 1 ml odczynnika TRIzol na 100 mg tkanki przy użyciu homogenizatora ze szkła teflonowego.
  3. Po odwirowaniu RNA wyekstrahowano chloroformem i wytrącono alkoholem izopropylowym. Próbki RNA następnie ponownie zawieszono w 100 µl H2O traktowanej DEPC. Następnie 10 μg całkowitego RNA potraktowano DNazą wolną od RNaz (  Qiagen  ) w 37°C przez 1 godzinę i ponownie oczyszczono przez ekstrakcję 3:1 fenol/chloroform, a następnie wytrącanie etanolem.
  4. Z oczyszczonego RNA, 1 μg zastosowano w zestawie SYBR GreenER Two-Step qRT-PCR  (  Invitrogen) do syntezy pierwszej nici cDNA i ilościowej reakcji PCR w czasie rzeczywistym (qRT-PCR). Wpływ okołoporodowej ekspozycji na Pb2+ na geny związane z wczesnym rozwojem neuronalnym i przesunięciem GABA oceniano poprzez ekspresję izoform Ca-β3, GABAAR-β3, NKCC1, KCC2 i GAD 80, 86, 65 i 67.
RNase+DNase detection kit
RNase+DNase detection kit

CircularRNA circ_0071269 knockdown chroni przed uszkodzeniem kardiomiopatii cukrzycowej przez oś microRNA-145/gasdermina A

Okrągłe RNA (circRNA) biorą udział w rozwoju i progresji kardiomiopatii cukrzycowej (DCM). Jednak konkretna funkcja i mechanizm leżący u podstaw circ_0071269 w DCM pozostają niejasne. W naszym badaniu ekspresję mRNA i miRNA  wykrywano  metodą ilościowej PCR w czasie rzeczywistym (qRT-PCR). W celu zbadania charakterystyki circ_0071269 zastosowano traktowanie RNazą  R i aktynomycyną D.  W celu określenia żywotności komórek, zawartości LDH w komórkach oraz poziomu interleukiny (IL)-1β i IL-18 przeprowadzono test Cell Counting Kit -8 (CCK-8), zestawy do dehydrogenazy mleczanowej (LDH) i ELISA  , odpowiednio. 
Śmiertelność komórek określono za pomocą cytometrii przepływowej, a Western blot dotyczył poziomów ekspresji białka. Ponadto przeprowadzono testy reporterowe lucyferazy i testy pull-down RNA w celu potwierdzenia związku wiązania między miR-145 i circ_0071269 lub gasderminą A (GSDMA). W celu oceny uszkodzenia mięśnia sercowego in vivo przeprowadzono echokardiografię, barwienie hematoksyliną i eozyną (HE) oraz barwienie immunohistochemiczne (IHC)  .
Odkryliśmy, że circ_0071269 ulegał znacznej nadekspresji w komórkach H9c2 po potraktowaniu wysokim poziomem glukozy. Powalenie circ_0071269 promowało żywotność komórek i hamowało odpowiedź zapalną, cytotoksyczność i piroptozę komórek H9c2  in vitro . Co więcej, circ_0071269 gąbki miR-145 w celu zwiększenia GSDMA. Inhibitor miR-145 antagonizował wpływ knockdown circ_0071269 na funkcje komórkowe komórek H9c2, podczas gdy wpływ miR-145 został zniesiony przez nadekspresję GSDMA . Tymczasem knockdown circ_0071269 osłabił dysfunkcję serca u myszy DM. W związku z tym circ_0071269 może promować rozwój DCM poprzez oś miR-145/GSDMA, a tym samym zapewnić nowy marker do leczenia DCM.

Circ_0001206 reguluje oś miR-665/CRKL, aby złagodzić uszkodzenie kardiomiocytów wywołane niedotlenieniem/reoksygenacją w zawale mięśnia sercowego

Zawał mięśnia sercowego (MI) to rodzaj choroby sercowo-naczyniowej spowodowanej martwicą mięśnia sercowego. Coraz więcej dowodów sugeruje, że okrągłe RNA (circRNA) odgrywają kluczową rolę w uszkodzeniu MI wywołanym niedotlenieniem/reoksygenacją serca (H/R).
Ustalono model niedotlenienia/reoksygenacji komórek H9C2 i wykryto ekspresję około 0001206  za  pomocą ilościowej reakcji łańcuchowej polimerazy w czasie rzeczywistym. Testy rybonukleazy R ( RNazy  R) i aktynomycyny D (Akt D) potwierdziły stabilność. Zestaw do liczenia komórek  -8 (CCK-8), testy western blot, TUNEL i cytometria przepływowa oceniały żywotność komórek i apoptozę komórek. Obniżanie RNA, immunoprecypitacja białek wiążących RNA (RIP) i testy reporterowe lucyferazy badały mechanizmy leżące u podstaw MI. Wszystkie dane eksperymentalne zostały przedstawione ze średnią ± odchylenie standardowe (SD) i P < 0,05 wskazywały na istotność statystyczną. Circ_0001206 miał niską ekspresję w komórkach H9C2 poddanych działaniu H/R. Circ_0001206 powstał w wyniku cyklizacji CRK, takiego jak protoonkogen, białko adaptacyjne (CRKL). Nadekspresja Circ_0001206 promowała żywotność komórek i hamowała apoptozę kardiomiocytów. Potwierdzono, że circ_0001206 reguluje ekspresję CRKL poprzez działanie jako konkurujący endogenny RNA (ceRNA) mikroRNA-665 (miR-665). CRKL odegrał ochronną rolę w MI.

Okrągły RNA circ_0000644 promuje progresję raka brodawkowatego tarczycy poprzez gąbkę miR-1205 i regulację ekspresji E2F3

Rozregulowanie kolistych RNA (circRNA) ułatwia nowotworzenie raka brodawkowatego tarczycy (PTC). Celem tego badania było określenie funkcji i mechanizmu circ_0000644 w regulowaniu rozwoju PTC. Ekspresje Circ_0000644, microRNA-1205 (miR-1205) i E2F czynnika transkrypcyjnego 3 (E2F3)  wykryto  za pomocą ilościowej reakcji łańcuchowej polimerazy w czasie rzeczywistym (qRT-PCR). Testy z aktynomycyną D (ActD) i rybonukleazą R ( RNaza  R) zastosowano do weryfikacji kołowej charakterystyki circ_0000644. Po stłumieniu circ_0000644 wzrost komórek PTC, migrację, inwazję i apoptozę oceniano odpowiednio za pomocą  zestawu do liczenia komórek -8 (CCK-8), testu Transwell i analizy cytometrii przepływowej.

RNase Activity Detection/Quantification Assay Kit (Fluorometric)

K934-100 Biovision each 574.8 EUR

DNase (RNase-free)

abx098138-1500U Abbexa 1500 U 543.6 EUR

DNA Methylation Detection Kit

K5082100 Biochain 1 kit 337 EUR

SEB Detection Kit

6030 Chondrex 1 kit 663.78 EUR

LPS Detection Kit

6039 Chondrex 1 kit 404 EUR

HMGB1 Detection Kit

6010 Chondrex 1 kit 903.9 EUR

Gliadin Detection Kit

6035 Chondrex 1 kit 377 EUR

DNASE I, RNASE FREE

DD0649 Bio Basic 50KU 537.64 EUR

Apoptotic DNA Ladder Detection Kit

EBA15100 EnoGene 100 assays 180 EUR

Apoptotic DNA Ladder Detection Kit

EBA1520 EnoGene 20 assays 55 EUR

Apoptotic DNA Ladder Detection Kit

EBA1550 EnoGene 50 assays 100 EUR

Apoptosis Detection Kit

ANXVKB-100T ImmunoStep 100 test 557.64 EUR

Apoptosis Detection Kit

ANXVKCFB-100T ImmunoStep 100 test 495.24 EUR

Apoptosis Detection Kit

ANXVKCFB7-100T ImmunoStep 100 test 495.24 EUR

Apoptosis Detection Kit

ANXVKDY-100T ImmunoStep 100 test 467.16 EUR

Apoptosis Detection Kit

ANXVKF-100T ImmunoStep 100 test 395.4 EUR

Apoptosis Detection Kit

ANXVKF7-100T ImmunoStep 100 test 395.4 EUR

Apoptosis Detection Kit

ANXVKPE-100T ImmunoStep 100 test 415.68 EUR

Autophagy Detection Kit

abx299014-50tests Abbexa 50 tests 627.6 EUR

Autophagy Detection Kit

abx299015-200tests Abbexa 200 tests 1045.2 EUR

Ubiquitin Detection Kit

SKT-131-20 Stressmarq 20 assays 594 EUR

Ara h6 Detection Kit

6042 Chondrex 1 kit 377 EUR

Ara h2 Detection Kit

6043 Chondrex 1 kit 377 EUR

RNase FREE, 250ml Bottle Removes RNase & DNAse

10-172 Genesee Scientific 1 Bottle/Unit 269 EUR

DNase I (RNase-free)

K1088-1000 ApexBio 1000U 50 EUR

DNase I (RNase-free)

K1088-10000 ApexBio 10000U 400 EUR

DNase I (RNase-free)

K1088-5000 ApexBio 5000U 224 EUR

Senescence Detection Kit

55R-1370 Fitzgerald 250 tests 854.4 EUR

Senescence Detection Kit

K2030-250 ApexBio 250 Staining 552 EUR

Senescence Detection Kit

K320-250 Biovision each 561.6 EUR

Mycoplasma detection kit

E28XB0087 EnoGene 50T 311.11 EUR

RNase-Free DNase Set

BS88253 Bio Basic 50preps 175.1 EUR

GenomeCoV19 Detection Kit

G628 ABM 100 Rxns 384 EUR

GenomeCoV19 Detection Kit

G628.v2 ABM 100 Rxns 384 EUR

Glutathione Detection Kit

SKT-202-96 Stressmarq 1 plate of 96 wells 513.6 EUR

Protein A Detection Kit

abx090813-1Kit Abbexa 1 Kit 1897.2 EUR

PCR-STEC Detection Kit

K1452-96 Biovision each 940.8 EUR

Rat Albumin Detection Kit

3020 Chondrex 1 kit 580.26 EUR

COVID19 PCR detection kit

BSV-qPCR-07 BioServUK 100 reactions Ask for price

Residual SDS Detection Kit

BSP055 Bio Basic 100Assays 99.67 EUR

Nitric Oxide Detection Kit

SKT-212-96 Stressmarq 2 plates of 96 wells 410.4 EUR

Quick Apoptotic DNA Ladder Detection Kit

K120-50 Biovision each 548.4 EUR

Quick Apoptotic DNA Ladder Detection Kit

K2194-50 ApexBio 50 assays 568.8 EUR

RNase FREE, 1 Liter Bottle Removes RNase & DNAse

10-173 Genesee Scientific 1 Bottle/Unit 337 EUR

RNase FREE, 4 Liter Bottle Removes RNase & DNAse

10-456 Genesee Scientific 1 Bottle/Unit 403 EUR

CHO Host Cell DNA Detection Kit in tubes

D550T Cygnus Technologies 1 kit (50 tubes) 1356 EUR

CHO Host Cell DNA Detection Kit in wells

D550W Cygnus Technologies 1 kit (96 wells plate) 1356 EUR

PCR Mycoplasma Detection Kit

abx098883-100rxns Abbexa 100 rxns 644.4 EUR

PCR Mycoplasma Detection Kit

abx298017-100rxns Abbexa 100 rxns 376.8 EUR

PCR Mycoplasma Detection Kit

M034-Kit TOKU-E Kit 319.2 EUR

Mycoplasma PCR Detection Kit

K1476-100 Biovision 100 Rxns 357.6 EUR

PCR Mycoplasma Detection Kit

E36G238 EnoGene 100 Reactions 228.57 EUR

E.coli Host Cell DNA Detection Kit in tubes

D410T Cygnus Technologies 1 kit (50 tubes) 1179.6 EUR

E.coli Host Cell DNA Detection Kit in wells

D410W Cygnus Technologies 1 kit (96 wells plate) 1179.6 EUR

RNase FREE, 475ml Spray Bottle Removes RNase & DNAse

10-228 Genesee Scientific 1 Spray Bottle/Unit 300 EUR

DNase I (not RNase FREE)

DD0099 Bio Basic 250mg 117.42 EUR

Enhanced Apoptotic DNA Ladder Detection Kit

K130-50 Biovision each 529.2 EUR

Enhanced Apoptotic DNA Ladder Detection Kit

K2202-50 ApexBio 50 assays 568.8 EUR

NS/0 Host Cell DNA Detection Kit in tubes

D220T Cygnus Technologies 1 kit (50 tubes) 1179.6 EUR

NS/0 Host Cell DNA Detection Kit in wells

D220W Cygnus Technologies 1 kit (96 wells plate) 1179.6 EUR

PCR-Salmonella Detection Kit

K1447-96 Biovision each 744 EUR

Urine Creatinine Detection Kit

SKT-200-192 Stressmarq 2 plates of 96 wells 410.4 EUR

Creatinine Serum Detection Kit

SKT-217-192 Stressmarq 2 plates of 96 wells 410.4 EUR

Human Host Cell DNA Detection Kit in tubes

D160T Cygnus Technologies 1 kit (50 tubes) 1179.6 EUR

Human Host Cell DNA Detection Kit in wells

D160W Cygnus Technologies 1 kit (96 wells plate) 1179.6 EUR

Hydrogen Peroxide Detection Kit

SKT-216-192 Stressmarq 2 plates of 96 wells 529.2 EUR

MitoStep + Apoptosis Detection Kit

KMAF-100T ImmunoStep 100 test 504.6 EUR

Ubiquitin Interact Detection Kit

SKT-132-20 Stressmarq 20 assays 556.8 EUR

PCR-Campylobacter Detection Kit

K1453-96 Biovision each 940.8 EUR

SARS-CoV-2 IgG Detection Kit (Colorimetric Anti-Spike RBD IgG detection)

79985 BPS Bioscience 96 rxns. 590 EUR

Mycoplasma Detection Kit (OKSB00010)

OKSB00010 Aviva Systems Biology 50 Tests 458.4 EUR

COVID-19 Antigen Detection Kit

BSV-G61RHA20 BioServUK 20 tests Ask for price

Luciferase Mycoplasma Detection Kit

20-abx098882 Abbexa
  • 1479.60 EUR
  • 627.60 EUR
  • 777.60 EUR
  • 200rxns
  • 25 rxns
  • 50 rxns

MitoCapture Apoptosis Detection Kit

55R-1305 Fitzgerald 25 assays 332.4 EUR

Luciferase Mycoplasma Detection Kit

20-abx298016 Abbexa
  • 1212.00 EUR
  • 360.00 EUR
  • 510.00 EUR
  • 200 rxns
  • 25 rxns
  • 50 rxns

SARS-CoV-2 IgG Detection Kit (Colorimetric Trimer Anti-Spike IgG detection)

79975 BPS Bioscience 96 rxns. 765 EUR

Blood Urea Nitrogen Detection Kit

SKT-213-192 Stressmarq 2 plates of 96 wells 513.6 EUR

TUNEL FITC Apoptosis Detection Kit

A111-01 Vazyme 20 rxn 339.6 EUR

TUNEL FITC Apoptosis Detection Kit

A111-02 Vazyme 50 rxn 490.8 EUR

TUNEL FITC Apoptosis Detection Kit

A111-03 Vazyme 100 rxn 646.8 EUR

PCR-Legionella spp Detection Kit

K1450-96 Biovision each 777.6 EUR

Senescence Detection Kit (Fluorometric)

K991-100 Biovision each 861.6 EUR

Formaldehyde Detection Kit (1 Plate)

K001-F1 Arbor Assays 2x96 well plate 448 EUR

ResiDNA Precise Quantitative CHO DNA Detection Kit

RD102-01 Vazyme 100 rxns (30 μl/rxn) 927.6 EUR

Rat Type I Collagen Detection Kit

6013 Chondrex 1 kit 808.2 EUR

Agarose Tablets , DNase/RNase Free

BIO-41027 Bioline 300g Ask for price

CRISPR Genomic Cleavage Detection Kit

G932 ABM 25 Reactions 246 EUR

CRISPR Genomic Cleavage Detection Kit

K1250-25 Biovision each 483.6 EUR

SDS 20%, DNase and RNase Free

41930020-1 Bio-WORLD 200 mL 47.72 EUR

Human Type I Collagen Detection Kit

6021 Chondrex 1 kit 886.5 EUR

Pure-IP Western Blot Detection Kit

PRB-5002 Cell Biolabs 20 blots 470.4 EUR

Mouse Type I Collagen Detection Kit

6012 Chondrex 1 kit 808.2 EUR

Cholesterol Detection Kit (cell-based)

K587-100 Biovision each 352.8 EUR

Human CCL5 Detection Assay Kit

6822 Chondrex 1 kit 580.26 EUR

NGAL (Detection Ab)

abx019242-100ug Abbexa 100 ug 777.6 EUR

TLR Detection Set

PSI-1806 ProSci 1 Set 1627.8 EUR

PD1 Detection Set

SD8600 ProSci 1 Set 537.9 EUR

TUNEL BrightRed Apoptosis Detection Kit

A113-01 Vazyme 20 rxn 367.2 EUR

TUNEL BrightRed Apoptosis Detection Kit

A113-02 Vazyme 50 rxn 547.2 EUR

TUNEL BrightRed Apoptosis Detection Kit

A113-03 Vazyme 100 rxn 786 EUR
Zależności regulacyjne między circ_0000644, E2F3 i miR-1205 potwierdzono w teście immunoprecypitacji RNA (RIP) i teście reporterowym z podwójną lucyferazą. Poza tym wpływy regulacyjne circ_0000644 na poziom białka E2F3 analizowano metodą Western blot. W PTC circ_0000644 wykazywał wysoką ekspresję i był zlokalizowany głównie w cytoplazmie i miał stabilną strukturę. Uderzenie circ_0000644 zahamowało wzrost, migrację i inwazję komórek PTC oraz ułatwiło apoptozę. Circ_0000644 mógł bezpośrednio oddziaływać z miR-1205 w celu zahamowania ekspresji miR-1205 i służył jako gąbka miR-1205 do modulowania ekspresji E2F3 w komórkach PTC. Circ_0000644 zwiększa ekspresję E2F3 przez gąbkowanie miR-1205 w celu promowania progresji PTC.

Dodaj komentarz