Wektory lentiwirusowe oparte na ludzkim wirusie niedoboru odporności typu 1 (HIV-1) mają zdolność dostarczania egzogennych genów zarówno do dzielących się, jak i niedzielących się komórek, a następnie ustanawiania stabilnego prowirusa w tych komórkach docelowych, co może umożliwić długotrwałą ekspresję przenoszonego genu . Tutaj opisujemy stabilną pakującą linię komórkową, która jest pozbawiona HIV-1 tat, vif, vpr, vpu i nef. W celu uniknięcia jakiegokolwiek ryzyka cytotoksyczności związanego z konstytutywną ekspresją proteazy HIV-1 lub białka otoczki VSV-G, transkrypcję konstruktów opakowania i otoczki ściśle kontrolowano przez zastosowanie układu indukowanego ekdyzonem .
Stosując tę linię komórkową, byliśmy w stanie konsekwentnie wytwarzać stężone zapasy pseudotypowanych wektorów wirusowych o mianach w zakresie 10(8) IU/ml, które mogą wydajnie transdukować aktywnie dzielące się i hamujące wzrost komórki in vitro. Ta nowatorska linia komórkowa pakująca wektory lentiwirusowe ułatwia wytwarzanie zapasów wirusa o wysokim mianie przy braku wirusa zdolnego do replikacji i dostarcza nam ważnego narzędzia do wykorzystania w przyszłych badaniach nad transferem genów.
Generowanie, pakowanie i transdukcja wirusów na cyfrowej platformie mikroprzepływowej
Systemy wirusowe są popularną metodą dostarczania do wprowadzania egzogennego materiału genetycznego do komórek ssaków. Niestety przygotowanie lentiwirusów zawierających maszynerię do edycji komórek jest pracochłonne, a etapy wymagają optymalizacji i delikatnej obsługi. Aby złagodzić te wyzwania, wprowadzamy pierwszą metodę mikroprzepływową, która łączy wytwarzanie, pakowanie i transdukcję lentiwirusa . Nowa metoda umożliwia wytwarzanie mian wirusów między 106 a 107 (podobnie jak produkcja w makroskali) i wysoką wydajność transdukcji w przypadku trudnych do transfekcji linii komórkowych.
Rozszerzamy tę technikę o aplikacje do edycji genów i pokazujemy, w jaki sposób można ją wykorzystać do wyłączenia i wyłączenia genu receptora estrogenowego – genu odpowiedzialnego za 70% przypadków raka piersi. Ta nowa technika jest zautomatyzowana dzięki możliwościom multipleksowania, które mają potencjał do standaryzacji metod inżynierii genomu opartego na wirusach.
Warunkowa ekspresja genu za pośrednictwem lentiwirusa
Zdolność do zidentyfikowania roli konkretnego genu w systemie zależy od kontroli ekspresji tego genu. W tym protokole opisujemy metodę stabilnej, warunkowej ekspresji receptorów Nod-Like (NLR) w komórkach THP-1 przy użyciu lentiwirusowego systemu ekspresji . System ten łączy wszystkie niezbędne składniki do indukowanej tetracykliną ekspresji genów w pojedynczym lentiwektorze z konstytutywną koekspresją markera selekcyjnego, co jest skutecznym sposobem kontrolowania ekspresji genów przy użyciu pojedynczej infekcji wirusowej komórek. Odbywa się to na platformie ekspresji lentiwirusów trzeciej generacji , która poprawia bezpieczeństwo lentiwirusów i pozwala na większą ekspresję genów niż poprzednie platformy lentiwirusowe .
- Plazmid ekspresyjny lentiwirusa jest najpierw modyfikowany tak, aby zawierał interesujący gen kierowany przez promotor TRE (element odpowiedzi tetracyklinowej) w prostym etapie klonowania bramy, a następnie jest kotransfekowany do komórek HEK293T wraz z plazmidami do pakowania i otoczki w celu wytworzenia wirusa .
- Wirus jest używany do infekowania interesującego typu komórki przy niskim MOI, tak że większość transdukowanych komórek zawiera pojedynczą integrację wirusa. Zakażone komórki hoduje się z selekcją, a integracja wirusa jest weryfikowana przez qPCR.
- Ekspresja genów w stabilnie stransdukowanych komórkach jest indukowana doksycykliną i walidowana przez qPCR, immunoblot i cytometrię przepływową.
- Ta elastyczna lentiwirusowa platforma ekspresyjna może być wykorzystywana do stabilnej i silnej indukcji interesującego genu w szeregu komórek do wielu zastosowań. Streszczenie graficzne: Schematyczny przegląd transdukcji lentiwirusowej komórek THP-1.
Minimalny wpływ ZAP na produkcję wektorów lentiwirusowych i wydajność transdukcji
Przeciwwirusowe białko ZAP wiąże dinukleotydy CpG w wirusowym RNA, hamując replikację. To prawdopodobnie doprowadziło do supresji CpG obserwowanej w wielu wirusach RNA, w tym retrowirusach. Sekwencje dodane do genomów wektorów retrowirusowych, takie jak promotory wewnętrzne, transgeny lub elementy regulatorowe, znacznie zwiększają liczebność CpG. Ponieważ te CpG mogą pozwolić ZAP na celowanie w retrowirusowy wektor RNA, przeanalizowaliśmy, czy ogranicza to wytwarzanie wektora, wydajność transdukcji i ekspresję transgenu.
Co zaskakujące, chociaż CpG-high HIV-1 był skutecznie hamowany przez ZAP w komórkach HEK293T, zubożenie ZAP nie zwiększyło istotnie miana wektora lentiwirusowego przy użyciu kilku plazmidów pakujących i genomowych. Nadekspresja ZAP również nie hamowała miana wektora lentiwirusowego . Ponadto, zmniejszenie liczebności CpG w genomie wektora lentiwirusowego nie zwiększyło jego miana , a wektor gammaretrowirusowy pochodzący z wirusa mysiej białaczki nie był istotnie ograniczany przez ZAP.
Ogólnie, pokazujemy, że zwiększona ilość CpG w wektorach retrowirusowych w porównaniu z retrowirusami typu dzikiego, z których pochodzą, nie uwrażliwia ich wewnętrznie na ZAP. Dalsze zrozumienie, w jaki sposób ZAP specyficznie celuje w transkrypty w celu zahamowania ich ekspresji, może pozwolić na opracowanie kontekstów sekwencji CpG, które skutecznie rekrutują lub omijają ten system przeciwwirusowy .
Przewodnik po produkcji wektorów lentiwirusowych dla trudnych do transfekcji komórek, z wykorzystaniem komórek z ekspresją c-kit pochodzących z serca jako systemu modelowego
Terapia genowa polega na modyfikowaniu składu genetycznego poprzez wprowadzanie obcych kwasów nukleinowych do docelowych komórek za pomocą metod dostarczania genów w celu leczenia konkretnej choroby. Chociaż docelowe geny odgrywają kluczową rolę w terapii genowej, zastosowany system dostarczania genów ma również ogromne znaczenie, ponieważ decyduje o powodzeniu terapii genowej. Ponieważ komórki pierwotne i komórki macierzyste są często komórkami docelowymi terapii genowej w badaniach klinicznych, system dostarczania musiałby być solidny, a wpisy oparte na wirusach, takie jak wektory lentiwirusowe , najlepiej sprawdzają się w transporcie transgenu do komórek. Jednak nawet w obrębie wektorów lentiwirusowych kilka parametrów może wpływać na funkcjonalność systemu dostarczania .
Wykorzystując pochodzące z serca komórki wyrażające c-kit (CC) jako układ modelowy , niniejsze badanie ma na celu optymalizację wytwarzania lentiwirusa poprzez zbadanie różnych czynników eksperymentalnych, takich jak wytwarzanie układu lentiwirusowego , metoda koncentracji i typ markera selekcyjnego. Nasze odkrycia wykazały, że system drugiej generacji z pCMV-dR8.2 dvpr jako plazmidem pakującym dawał 7,3-krotnie wyższą wydajność produkcji lentiwirusa w porównaniu z psPAX2.
ViraSafe Lentiviral Packaging System, Ecotropic |
|||
| VPK-205 | Cell Biolabs | 1 kit | 1069.2 EUR |
ViraSafe Lentiviral Packaging System, Pantropic |
|||
| VPK-206 | Cell Biolabs | 1 kit | 1069.2 EUR |
ViraSafe Universal Lentiviral Expression System, Ecotropic |
|||
| VPK-211-ECO | Cell Biolabs | 1 kit | 1395.6 EUR |
ViraSafe Universal Lentiviral Expression System, Pantropic |
|||
| VPK-211-PAN | Cell Biolabs | 1 kit | 1395.6 EUR |
ViraSafe Lentiviral Expression System (Puro), Ecotropic |
|||
| VPK-212-ECO | Cell Biolabs | 1 kit | 1395.6 EUR |
ViraSafe Lentiviral Expression System (Puro), Pantropic |
|||
| VPK-212-PAN | Cell Biolabs | 1 kit | 1395.6 EUR |
ViraSafe Lentiviral Expression System (Neo) Ecotropic |
|||
| VPK-213-ECO | Cell Biolabs | 1 kit | 1395.6 EUR |
ViraSafe Lentiviral Expression System (Neo), Pantropic |
|||
| VPK-213-PAN | Cell Biolabs | 1 kit | 1395.6 EUR |
ViraSafe Lentiviral Expression System (Hygro), Ecotropic |
|||
| VPK-214-ECO | Cell Biolabs | 1 kit | 1395.6 EUR |
ViraSafe Lentiviral Expression System (Hygro), Pantropic |
|||
| VPK-214-PAN | Cell Biolabs | 1 kit | 1395.6 EUR |
ViraSafe Lentiviral Bicistronic Expression System (Puro), Ecotropic |
|||
| VPK-215-ECO | Cell Biolabs | 1 kit | 1395.6 EUR |
ViraSafe Lentiviral Bicistronic Expression System (Puro), Pantropic |
|||
| VPK-215-PAN | Cell Biolabs | 1 kit | 1395.6 EUR |
ViraSafe Lentiviral Bicistronic Expression System (Neo), Ecotropic |
|||
| VPK-216-ECO | Cell Biolabs | 1 kit | 1395.6 EUR |
ViraSafe Lentiviral Bicistronic Expression System (Neo), Pantropic |
|||
| VPK-216-PAN | Cell Biolabs | 1 kit | 1395.6 EUR |
ViraSafe Lentiviral Bicistronic Expression System (Hygro), Ecotropic |
|||
| VPK-217-ECO | Cell Biolabs | 1 kit | 1395.6 EUR |
ViraSafe Lentiviral Bicistronic Expression System (Hygro), Pantropic |
|||
| VPK-217-PAN | Cell Biolabs | 1 kit | 1395.6 EUR |
ViraSafe Lentiviral Bicistronic Expression System (Blasticidin), Ecotropic |
|||
| VPK-219-ECO | Cell Biolabs | 1 kit | 1395.6 EUR |
ViraSafe Lentiviral Bicistronic Expression System (Blasticidin), Pantropic |
|||
| VPK-219-PAN | Cell Biolabs | 1 kit | 1395.6 EUR |
AAV-DJ Helper Free Packaging System |
|||
| VPK-400-DJ | Cell Biolabs | 1 kit | 1166.4 EUR |
AAV-1 Helper Free Packaging System |
|||
| VPK-401 | Cell Biolabs | 1 kit | 1166.4 EUR |
AAV-2 Helper Free Packaging System |
|||
| VPK-402 | Cell Biolabs | 1 kit | 1166.4 EUR |
AAV-3 Helper Free Packaging System |
|||
| VPK-403 | Cell Biolabs | 1 kit | 1166.4 EUR |
AAV-4 Helper Free Packaging System |
|||
| VPK-404 | Cell Biolabs | 1 kit | 1166.4 EUR |
AAV-5 Helper Free Packaging System |
|||
| VPK-405 | Cell Biolabs | 1 kit | 1166.4 EUR |
AAV-6 Helper Free Packaging System |
|||
| VPK-406 | Cell Biolabs | 1 kit | 1166.4 EUR |
AAV-DJ/8 Helper Free Packaging System |
|||
| VPK-400-DJ-8 | Cell Biolabs | 1 kit | 1166.4 EUR |
pPACK-ID: Integrase-defective lentiviral packaging mix (15 reactions) |
|||
| LV520A-ID | SBI | 15 reactions | 836.4 EUR |
pPACK-ID: Integrase-defective lentiviral packaging mix (30 reactions) |
|||
| LV525A-ID | SBI | 30 reactions | 1358.4 EUR |
SynaptoGreenâ„¢ C3 (special packaging): (5x1mg) |
|||
| 70026 | Biotium | 5ST | 384 EUR |
SynaptoGreen C1(special packaging): (5x1mg) |
|||
| 70043 | Biotium | 5ST | 384 EUR |
SynaptoGreen C5 (special packaging): (5x1mg) |
|||
| 70047 | Biotium | 5ST | 384 EUR |
Gryphon Packaging Cell Selection Medium |
|||
| ABP-TC-PHSM050 | Allele Biotech | 50 ml | Ask for price |
pPACKF1 FIV Lentivector Packaging Kit |
|||
| LV100A-1 | SBI | 10 transfections | 739.2 EUR |
pPACKH1 HIV Lentivector Packaging Kit |
|||
| LV500A-1 | SBI | 10 transfections | 709.2 EUR |
pPACKH1-XL HIV Lentivector Packaging Kit |
|||
| LV510A-1 | SBI | 25 transfections | 1490.4 EUR |
ProtoBlock System |
|||
| NAT1004 | Scientific Laboratory Supplies | 1KIT | 71.82 EUR |
New system |
|||
| VS10WPGS2 | Scientific Laboratory Supplies | EACH | 80.94 EUR |
pPACKF1 FIV Lentivector Packaging Kit (50 reactions) |
|||
| LV100A-5 | SBI | 50 transfections | 2809.2 EUR |
Platinum-E Retroviral Packaging Cell Line, Ecotropic |
|||
| RV-101 | Cell Biolabs | 1 vial | 1104 EUR |
Platinum-A Retroviral Packaging Cell Line, Amphotropic |
|||
| RV-102 | Cell Biolabs | 1 vial | 1104 EUR |
Platinum-GP Retroviral Packaging Cell Line, Pantropic |
|||
| RV-103 | Cell Biolabs | 1 vial | 1104 EUR |
pPACK-BALD Envelope-Free Lentivector Packaging Mix |
|||
| LV550A-1 | SBI | 10 rxn | 529 EUR |
CometAssay Electrophoresis System |
|||
| 4250-050-ES | Biotechne | 1 Kit | 3540.96 EUR |
Cometslides Rack System |
|||
| 4252-040-02 | Biotechne | 1 Each | 256.56 EUR |
CCD cooling system |
|||
| 3600100 | Atto | 1unit | 5896.8 EUR |
Fast Mutagenesis System |
|||
| 20-abx098073 | Abbexa |
|
|
data acquisition system |
|||
| D230 | Consort | ea | 2044.8 EUR |
AEC coloring system |
|||
| CT356 | U-CyTech | 10-plate | 169.2 EUR |
photo documentation system |
|||
| VLBPCX4-20M | Consort | ea | 7622.4 EUR |
photo documentation system |
|||
| VLBPCX4-20MX | Consort | ea | 8128.8 EUR |
photo documentation system |
|||
| VLDP-HOOD | Consort | ea | 6100.8 EUR |
photo documentation system |
|||
| VLDP17-26M | Consort | ea | 9751.2 EUR |
photo documentation system |
|||
| VLDP17-26MX | Consort | ea | 10156.8 EUR |
Heidolph clamping system |
|||
| 509-63100-00 | Scientific Laboratory Supplies | EACH | 135.66 EUR |
Campact Vacuum System |
|||
| AC701 | Scientific Laboratory Supplies | EACH | 2531.94 EUR |
Extractor System Option |
|||
| DRY1128 | Scientific Laboratory Supplies | EACH | 476.52 EUR |
IsoTherm-System Starter |
|||
| E3880001018 | Scientific Laboratory Supplies | EACH | 163.02 EUR |
miniONE Electrophoresis System |
|||
| ELE3400 | Scientific Laboratory Supplies | EACH | 624.72 EUR |
Disposable Bag System |
|||
| H20CBS50 | Scientific Laboratory Supplies | EACH | 165.3 EUR |
Lower cooling system |
|||
| WAT4796 | Scientific Laboratory Supplies | EACH | 984.96 EUR |
Digestive system (esophagus |
|||
| GI1441 | TissueArray | each | 306 EUR |
Digestive system (esophagus |
|||
| GI701a | TissueArray | each | 222 EUR |
Propane Transfer System |
|||
| M-CEM-37015 | MiTeGen | 1 UNIT | 625 EUR |
Watershed System Kit |
|||
| M-WS180320-1 | MiTeGen | 1 KIT | 9296 EUR |
Kinesis Membrane Filter empty packaging for samples; 13mm |
|||
| FIL1013 | Scientific Laboratory Supplies | EACH | 4.59 EUR |
Kinesis Membrane Filter empty packaging for samples; 25mm |
|||
| FIL1015 | Scientific Laboratory Supplies | EACH | 4.59 EUR |
Kinesis Membrane Filter empty packaging for samples; 47mm |
|||
| FIL1016 | Scientific Laboratory Supplies | EACH | 4.59 EUR |
pPACK-BALD Envelope-Free Lentivector Packaging Mix (XL) |
|||
| LV555A-1 | SBI | 25 rxn | 1167 EUR |
FractionPREP Cell Fractionation system |
|||
| 55R-1359 | Fitzgerald | 50 assays | 909.6 EUR |
Fast MultiSite Mutagenesis System |
|||
| abx098861-10rxns | Abbexa | 10 rxns | 828 EUR |
myGel Mini Electrophoresis System |
|||
| BM0286 | GenDepot | System | 741.6 EUR |
cfMAX cfDNA Isolation System |
|||
| CFMAX100A-1 | SBI | 1 Kit | 574.8 EUR |
mini system 7x8 cm |
|||
| EHS3100-SYS | Consort | ea | 524.4 EUR |
EasyDip Slide Staining System |
|||
| M900-12AS-ASSORTED | ScyTek Laboratories | 1 Case(s) | 211.2 EUR |
mini system 8x10 cm |
|||
| EHS1050-SYS | Consort | ea | 422.4 EUR |
modular system 10x10 cm |
|||
| EVS1100-MULTI | Consort | ea | 1436.4 EUR |
modular system 20x10 cm |
|||
| EVS1200-MULTI | Consort | ea | 1741.2 EUR |
modular system 20x20 cm |
|||
| EVS1300-MULTI | Consort | ea | 2349.6 EUR |
vertical system 10x10 cm |
|||
| EVS3100-SYS | Consort | ea | 930 EUR |
vertical system 20x10 cm |
|||
| EVS3200-SYS | Consort | ea | 1741.2 EUR |
vertical system 20x20 cm |
|||
| EVS3300-SYS | Consort | ea | 2044.8 EUR |
sequencing system 20x50 cm |
|||
| ESEQ1200-SYS | Consort | ea | 1842 EUR |
BCIP/NBT Substrate System |
|||
| GR103022 | Genorise Scientific | 2 x 25 mL | 142.8 EUR |
AP Fluorescent Substrate System |
|||
| GR103053 | Genorise Scientific | Each | 99.6 EUR |
HRP Floresce Substrate System |
|||
| GR103054 | Genorise Scientific | Each | 99.6 EUR |
96-Well Vacuum System |
|||
| SD5011 | Bio Basic | 1 UNIT | 388.86 EUR |
Episomal iPSC Reprogramming System |
|||
| SC900A-1 | SBI | 5 reactions | 1161.6 EUR |
amfiRivert Reverse Transcription System |
|||
| R5200-050 | GenDepot | 50 rxns | 465.6 EUR |
MiniVac Waste Aspiration System |
|||
| ARG1464 | Scientific Laboratory Supplies | EACH | 254.22 EUR |
Ez C02 System Sachets |
|||
| 260679 | Scientific Laboratory Supplies | PK20 | 126.54 EUR |
Ez Campy System Sachets |
|||
| 260680 | Scientific Laboratory Supplies | PK20 | 64.98 EUR |
Ez Anaerobe Pouch System |
|||
| 260683 | Scientific Laboratory Supplies | PK20 | 117.42 EUR |
Dual Spot PLUS System |
|||
| MIC2516 | Scientific Laboratory Supplies | EACH | 938.22 EUR |
VeriClean Triple Bucket System |
|||
| CLE9830 | Scientific Laboratory Supplies | EACH | 1629.06 EUR |
Nalgene System 100 Cryobox |
|||
| CRY8305 | Scientific Laboratory Supplies | PK10 | 199.5 EUR |
Syngene DigiGenius System DG1 |
|||
| ELE7500 | Scientific Laboratory Supplies | EACH | 2394 EUR |
Syngene InGenius 3 System |
|||
| ELE7540 | Scientific Laboratory Supplies | EACH | 4075.5 EUR |
Syngene GBox F3 System |
|||
| ELE7580 | Scientific Laboratory Supplies | EACH | 8413.2 EUR |
Foot Pedal Complete System |
|||
| FLY1234 | Scientific Laboratory Supplies | EACH | 706.8 EUR |
Axygen Gel Documentation System |
|||
| GD-1000 | Scientific Laboratory Supplies | EACH | 5947.38 EUR |
Zatężenie wirusa w ultrawirówce dało wyższe miano wirusa przy ponad 5 × 105 jednostek zakaźnych/ml (IFU/ml). I wreszcie, minimalne stężenie hamujące (MIC) markera selekcji puromycyną wynosiło 10 μg/ml i 7 μg/ml dla HEK293T i CC, co wskazuje na przydatność selekcji antybiotykowej dla wszystkich typów komórek. Te zachęcające dane można ekstrapolować i zastosować do innych trudnych do transfekcji komórek, takich jak różne typy komórek macierzystych lub komórki pierwotne.