Indukowalny system komórek pakujących do bezpiecznej i wydajnej produkcji wektorów lentiwirusowych przy braku białek pomocniczych HIV-1

Wektory lentiwirusowe oparte na ludzkim wirusie niedoboru odporności typu 1 (HIV-1) mają zdolność dostarczania egzogennych genów zarówno do dzielących się, jak i niedzielących się komórek, a następnie ustanawiania stabilnego prowirusa w tych komórkach docelowych, co może umożliwić długotrwałą ekspresję przenoszonego genu . Tutaj opisujemy stabilną pakującą linię komórkową, która jest pozbawiona HIV-1 tat, vif, vpr, vpu i nef. W celu uniknięcia jakiegokolwiek ryzyka cytotoksyczności związanego z konstytutywną ekspresją proteazy HIV-1 lub białka otoczki VSV-G, transkrypcję konstruktów opakowania i otoczki ściśle kontrolowano przez zastosowanie układu indukowanego ekdyzonem .
Stosując tę ​​linię komórkową, byliśmy w stanie konsekwentnie wytwarzać stężone zapasy pseudotypowanych wektorów wirusowych o mianach w zakresie 10(8) IU/ml, które mogą wydajnie transdukować aktywnie dzielące się i hamujące wzrost komórki in vitro. Ta nowatorska linia komórkowa pakująca wektory lentiwirusowe ułatwia wytwarzanie zapasów wirusa o wysokim mianie przy braku wirusa zdolnego do replikacji i dostarcza nam ważnego narzędzia do wykorzystania w przyszłych badaniach nad transferem genów.

Generowanie,  pakowanie i transdukcja wirusów na cyfrowej platformie mikroprzepływowej

Systemy wirusowe   są popularną metodą dostarczania do wprowadzania egzogennego materiału genetycznego do komórek ssaków. Niestety przygotowanie lentiwirusów zawierających maszynerię do edycji komórek jest pracochłonne, a etapy wymagają optymalizacji i delikatnej obsługi. Aby złagodzić te wyzwania, wprowadzamy pierwszą metodę mikroprzepływową, która łączy   wytwarzanie,  pakowanie i transdukcję lentiwirusa . Nowa metoda umożliwia wytwarzanie mian wirusów między 106  a 107  (podobnie jak produkcja w makroskali) i wysoką wydajność transdukcji w przypadku trudnych do transfekcji linii komórkowych.
Rozszerzamy tę technikę o aplikacje do edycji genów i pokazujemy, w jaki sposób można ją wykorzystać do wyłączenia i wyłączenia genu receptora estrogenowego – genu odpowiedzialnego za 70% przypadków raka piersi. Ta nowa technika jest zautomatyzowana dzięki możliwościom multipleksowania, które mają potencjał do standaryzacji metod inżynierii genomu opartego na wirusach.

Warunkowa ekspresja genu za pośrednictwem lentiwirusa

Zdolność do zidentyfikowania roli konkretnego genu w  systemie  zależy od kontroli ekspresji tego genu. W tym protokole opisujemy metodę stabilnej, warunkowej ekspresji receptorów Nod-Like (NLR) w komórkach THP-1 przy użyciu  lentiwirusowego systemu  ekspresji  . System ten   łączy wszystkie niezbędne składniki do indukowanej tetracykliną ekspresji genów w pojedynczym lentiwektorze z konstytutywną koekspresją markera selekcyjnego, co jest skutecznym sposobem kontrolowania ekspresji genów przy użyciu pojedynczej infekcji wirusowej komórek. Odbywa się to na  platformie ekspresji lentiwirusów trzeciej generacji  , która poprawia bezpieczeństwo lentiwirusów i pozwala na większą ekspresję genów niż poprzednie  platformy lentiwirusowe .
  • Plazmid  ekspresyjny lentiwirusa  jest najpierw modyfikowany tak, aby zawierał interesujący gen kierowany przez promotor TRE (element odpowiedzi tetracyklinowej) w prostym etapie klonowania bramy, a następnie jest kotransfekowany do komórek HEK293T wraz z  plazmidami do pakowania  i otoczki w celu wytworzenia wirusa .
  • Wirus jest używany do infekowania interesującego typu komórki przy niskim MOI, tak że większość transdukowanych komórek zawiera pojedynczą integrację wirusa. Zakażone komórki hoduje się z selekcją, a integracja wirusa jest weryfikowana przez qPCR.
  • Ekspresja genów w stabilnie stransdukowanych komórkach jest indukowana doksycykliną i walidowana przez qPCR, immunoblot i cytometrię przepływową.
  • Ta elastyczna  lentiwirusowa  platforma ekspresyjna może być wykorzystywana do stabilnej i silnej indukcji interesującego genu w szeregu komórek do wielu zastosowań. Streszczenie graficzne: Schematyczny przegląd  transdukcji lentiwirusowej  komórek THP-1.
ViraSafe Lentiviral Packaging System
ViraSafe Lentiviral Packaging System

Minimalny wpływ ZAP na  produkcję wektorów lentiwirusowych  i wydajność transdukcji

Przeciwwirusowe białko ZAP wiąże dinukleotydy CpG w wirusowym RNA, hamując replikację. To prawdopodobnie doprowadziło do supresji CpG obserwowanej w wielu wirusach RNA, w tym retrowirusach. Sekwencje dodane do genomów wektorów retrowirusowych, takie jak promotory wewnętrzne, transgeny lub elementy regulatorowe, znacznie zwiększają liczebność CpG. Ponieważ te CpG mogą pozwolić ZAP na celowanie w retrowirusowy wektor RNA, przeanalizowaliśmy, czy ogranicza to wytwarzanie wektora, wydajność transdukcji i ekspresję transgenu.
Co zaskakujące, chociaż CpG-high HIV-1 był skutecznie hamowany przez ZAP w komórkach HEK293T, zubożenie ZAP nie zwiększyło istotnie   miana wektora  lentiwirusowego przy użyciu kilku plazmidów pakujących  i genomowych. Nadekspresja ZAP również nie  hamowała  miana wektora lentiwirusowego . Ponadto, zmniejszenie liczebności CpG w  genomie wektora lentiwirusowego  nie zwiększyło jego miana , a wektor gammaretrowirusowy pochodzący z wirusa mysiej białaczki nie był istotnie ograniczany przez ZAP.
Ogólnie, pokazujemy, że zwiększona ilość CpG w wektorach retrowirusowych w porównaniu z retrowirusami typu dzikiego, z których pochodzą, nie uwrażliwia ich wewnętrznie na ZAP. Dalsze zrozumienie, w jaki sposób ZAP specyficznie celuje w transkrypty w celu zahamowania ich ekspresji, może pozwolić na opracowanie kontekstów sekwencji CpG, które skutecznie rekrutują lub omijają ten  system przeciwwirusowy .

Przewodnik po  produkcji wektorów lentiwirusowych  dla trudnych do transfekcji komórek, z wykorzystaniem komórek z ekspresją c-kit pochodzących z serca jako  systemu modelowego

Terapia genowa polega na modyfikowaniu składu genetycznego poprzez wprowadzanie obcych kwasów nukleinowych do docelowych komórek za pomocą metod dostarczania genów w celu leczenia konkretnej choroby. Chociaż docelowe geny odgrywają kluczową rolę w terapii genowej,  zastosowany system dostarczania genów  ma również ogromne znaczenie, ponieważ decyduje o powodzeniu terapii genowej. Ponieważ komórki pierwotne i komórki macierzyste są często komórkami docelowymi terapii genowej w badaniach klinicznych,  system dostarczania  musiałby być solidny, a wpisy oparte na wirusach, takie jak  wektory lentiwirusowe  , najlepiej sprawdzają się w transporcie transgenu do komórek. Jednak nawet w obrębie  wektorów lentiwirusowych  kilka parametrów może wpływać na funkcjonalność  systemu dostarczania .
Wykorzystując pochodzące z serca komórki wyrażające c-kit (CC) jako układ modelowy  , niniejsze badanie ma na celu optymalizację  wytwarzania lentiwirusa  poprzez zbadanie różnych czynników eksperymentalnych, takich jak wytwarzanie układu lentiwirusowego , metoda koncentracji i typ markera selekcyjnego. Nasze odkrycia wykazały, że system drugiej generacji  z  pCMV-dR8.2 dvpr jako  plazmidem pakującym  dawał 7,3-krotnie wyższą wydajność  produkcji lentiwirusa w  porównaniu z psPAX2.

ViraSafe Lentiviral Packaging System, Ecotropic

VPK-205 Cell Biolabs 1 kit 891 EUR

ViraSafe Lentiviral Packaging System, Pantropic

VPK-206 Cell Biolabs 1 kit 891 EUR

ViraSafe Universal Lentiviral Expression System, Ecotropic

VPK-211-ECO Cell Biolabs 1 kit 1163 EUR

ViraSafe Universal Lentiviral Expression System, Pantropic

VPK-211-PAN Cell Biolabs 1 kit 1163 EUR

ViraSafe Lentiviral Expression System (Puro), Ecotropic

VPK-212-ECO Cell Biolabs 1 kit 1163 EUR

ViraSafe Lentiviral Expression System (Puro), Pantropic

VPK-212-PAN Cell Biolabs 1 kit 1163 EUR

ViraSafe Lentiviral Expression System (Neo) Ecotropic

VPK-213-ECO Cell Biolabs 1 kit 1163 EUR

ViraSafe Lentiviral Expression System (Neo), Pantropic

VPK-213-PAN Cell Biolabs 1 kit 1163 EUR

ViraSafe Lentiviral Expression System (Hygro), Ecotropic

VPK-214-ECO Cell Biolabs 1 kit 1163 EUR

ViraSafe Lentiviral Expression System (Hygro), Pantropic

VPK-214-PAN Cell Biolabs 1 kit 1163 EUR

ViraSafe Lentiviral Bicistronic Expression System (Puro), Ecotropic

VPK-215-ECO Cell Biolabs 1 kit 1163 EUR

ViraSafe Lentiviral Bicistronic Expression System (Puro), Pantropic

VPK-215-PAN Cell Biolabs 1 kit 1163 EUR

ViraSafe Lentiviral Bicistronic Expression System (Neo), Ecotropic

VPK-216-ECO Cell Biolabs 1 kit 1163 EUR

ViraSafe Lentiviral Bicistronic Expression System (Neo), Pantropic

VPK-216-PAN Cell Biolabs 1 kit 1163 EUR

ViraSafe Lentiviral Bicistronic Expression System (Hygro), Ecotropic

VPK-217-ECO Cell Biolabs 1 kit 1163 EUR

ViraSafe Lentiviral Bicistronic Expression System (Hygro), Pantropic

VPK-217-PAN Cell Biolabs 1 kit 1163 EUR

ViraSafe Lentiviral Bicistronic Expression System (Blasticidin), Ecotropic

VPK-219-ECO Cell Biolabs 1 kit 1163 EUR

ViraSafe Lentiviral Bicistronic Expression System (Blasticidin), Pantropic

VPK-219-PAN Cell Biolabs 1 kit 1163 EUR

AAV-DJ Helper Free Packaging System

VPK-400-DJ Cell Biolabs 1 kit 972 EUR

AAV-1 Helper Free Packaging System

VPK-401 Cell Biolabs 1 kit 972 EUR

AAV-2 Helper Free Packaging System

VPK-402 Cell Biolabs 1 kit 972 EUR

AAV-3 Helper Free Packaging System

VPK-403 Cell Biolabs 1 kit 972 EUR

AAV-4 Helper Free Packaging System

VPK-404 Cell Biolabs 1 kit 972 EUR

AAV-5 Helper Free Packaging System

VPK-405 Cell Biolabs 1 kit 972 EUR

AAV-6 Helper Free Packaging System

VPK-406 Cell Biolabs 1 kit 972 EUR

AAV-DJ/8 Helper Free Packaging System

VPK-400-DJ-8 Cell Biolabs 1 kit 972 EUR

Lentivirus Packaging Kit

P904 101Bio - Ask for price

Retrovirus Packaging Kit

P905 101Bio - Ask for price

SynaptoGreenâ„¢ C3 (special packaging): (5x1mg)

70026 Biotium 5ST 320 EUR

SynaptoGreen C5 (special packaging): (5x1mg)

70047 Biotium 5ST 320 EUR

Gryphon Packaging Cell Selection Medium

ABP-TC-PHSM050 Allele Biotech 50 ml Ask for price

pPACKF1 FIV Lentivector Packaging Kit

LV100A-1 SBI 10 transfections 616 EUR

pPACKH1 HIV Lentivector Packaging Kit

LV500A-1 SBI 10 transfections 591 EUR

pPACK-ID: Integrase-defective lentiviral packaging mix (15 reactions)

LV520A-ID SBI 15 reactions 697 EUR

pPACK-ID: Integrase-defective lentiviral packaging mix (30 reactions)

LV525A-ID SBI 30 reactions 1132 EUR

pPACKH1-XL HIV Lentivector Packaging Kit

LV510A-1 SBI 25 transfections 1242 EUR

Platinum-E Retroviral Packaging Cell Line, Ecotropic

RV-101 Cell Biolabs 1 vial 920 EUR

Platinum-A Retroviral Packaging Cell Line, Amphotropic

RV-102 Cell Biolabs 1 vial 920 EUR

Platinum-GP Retroviral Packaging Cell Line, Pantropic

RV-103 Cell Biolabs 1 vial 920 EUR

pPACKF1 FIV Lentivector Packaging Kit (50 reactions)

LV100A-5 SBI 50 transfections 2341 EUR

ProtoBlock System

NAT1004 National Diagnostics 1KIT 102 EUR

data acquisition system

D230 Consort ea 1704 EUR

CCD cooling system

3600100 Atto 1unit 4914 EUR

Fast Mutagenesis System

20-abx098073 Abbexa
  • 509.00 EUR
  • 592.00 EUR
  • 10 rxns
  • 20 rxns

CometAssay Electrophoresis System

4250-050-ES Biotechne 1 Kit 2950.8 EUR

Cometslides Rack System

4252-040-02 Biotechne 1 Each 213.8 EUR

photo documentation system

VLBPCX4-20M Consort ea 6352 EUR

photo documentation system

VLBPCX4-20MX Consort ea 6774 EUR

photo documentation system

VLDP-HOOD Consort ea 5084 EUR

photo documentation system

VLDP17-26M Consort ea 8126 EUR

photo documentation system

VLDP17-26MX Consort ea 8464 EUR

AEC coloring system

CT356 U-CyTech 10-plate 141 EUR

SynaptoRed C2M, special packaging (also known as FM5-95): (5x1mg)

70019 Biotium 5ST 401 EUR

CMV-hspCas9-T2A-Puro SmartNuclease Lentivector Plasmid + LentiStarter Packaging Kit

CASLV100PA-KIT SBI 1 Kit 1132 EUR

CMV-hspCas9-EF1-GFP SmartNuclease Lentivector Plasmid + LentiStarter Packaging Kit

CASLV105PA-KIT SBI 1 Kit 1132 EUR

MSCV-hspCas9-T2A-Puro SmartNuclease Lentivector Plasmid + LentiStarter Packaging Kit

CASLV120PA-KIT SBI 1 Kit 1132 EUR

MSCV-hspCas9-EF1-GFP SmartNuclease Lentivector Plasmid + LentiStarter Packaging Kit

CASLV125PA-KIT SBI 1 Kit 1132 EUR

sequencing system 20x50 cm

ESEQ1200-SYS Consort ea 1535 EUR

modular system 10x10 cm

EVS1100-MULTI Consort ea 1197 EUR

modular system 20x10 cm

EVS1200-MULTI Consort ea 1451 EUR

modular system 20x20 cm

EVS1300-MULTI Consort ea 1958 EUR

vertical system 10x10 cm

EVS3100-SYS Consort ea 775 EUR

vertical system 20x10 cm

EVS3200-SYS Consort ea 1451 EUR

vertical system 20x20 cm

EVS3300-SYS Consort ea 1704 EUR

mini system 7x8 cm

EHS3100-SYS Consort ea 437 EUR

mini system 8x10 cm

EHS1050-SYS Consort ea 352 EUR

Fast MultiSite Mutagenesis System

abx098861-10rxns Abbexa 10 rxns 690 EUR

myGel Mini Electrophoresis System

BM0286 GenDepot System 618 EUR

96-Well Vacuum System

SD5011 Bio Basic 1 UNIT 324.05 EUR

amfiRivert Reverse Transcription System

R5200-050 GenDepot 50 rxns 388 EUR

EasyDip Slide Staining System

M900-12AS-ASSORTED ScyTek Laboratories 1 Case(s) 176 EUR

cfMAX cfDNA Isolation System

CFMAX100A-1 SBI 1 Kit 479 EUR

Episomal iPSC Reprogramming System

SC900A-1 SBI 5 reactions 968 EUR

FractionPREP Cell Fractionation system

55R-1359 Fitzgerald 50 assays 758 EUR

mini vertical system 10x10 cm

EVS1100-SYS Consort ea 606 EUR

mini vertical system 20x10 cm

EVS1200-SYS Consort ea 859 EUR

maxi vertical system 20x20 cm

EVS1300-SYS Consort ea 1138 EUR

data acquisition system 120 vac

D230-US Consort ea 1704 EUR

AXYGEN® GEL DOCUMENTATION SYSTEM

GD-1000 CORNING 1/pk 4670 EUR

EpiNext DNA Purification HT System

P-1063 EpiGentek 480 ml 6022.55 EUR

Platinum Retroviral Expression System, Ecotropic

VPK-300 Cell Biolabs 1 kit 1169 EUR

Platinum Retroviral Expression System, Amphotropic

VPK-301 Cell Biolabs 1 kit 1169 EUR

Platinum Retroviral Expression System, Pantropic

VPK-302 Cell Biolabs 1 kit 1169 EUR

Rabbit Reticulocyte Lysate System (untreated)

20-abx800016 Abbexa
  • 6759.00 EUR
  • 5924.00 EUR
  • 4281.00 EUR
  • 100 ml
  • 500 ml
  • 50 ml

SequaGel Sequencing System 1L Kit

NAT1136 National Diagnostics 1KIT 143 EUR

SequaGel Sequencing System 2.2L Kit

NAT1138 National Diagnostics EACH 211 EUR

HISTAR DETECTION SYSTEM Kits (OKSA11259)

OKSA11259 Aviva Systems Biology 50 Tests 565 EUR

HISTAR DETECTION SYSTEM Kits (OKSA11260)

OKSA11260 Aviva Systems Biology 150 Tests 1335 EUR

HISTAR DETECTION SYSTEM Kits (OKSA11261)

OKSA11261 Aviva Systems Biology 500 Tests 2019 EUR

Manual Staining System (12 Wells)

IMS001 ScyTek Laboratories 1 ea. 356 EUR

Slidefile Storage System 100 Positions

M700-100W-WHITE ScyTek Laboratories 1 Case(s) 192 EUR

Stain Tray Slide Staining System

M920-1 ScyTek Laboratories 1 Clear 428 EUR

Stain Tray Slide Staining System

M920-2 ScyTek Laboratories 1 Black 445 EUR

Gryphon Retroviral Expression System I

ABP-RVK-10001 Allele Biotech 1 set Ask for price

Gryphon Retroviral Expression System II

ABP-RVK-10002 Allele Biotech 1 set Ask for price

Gryphon Amphotropic Packaging Cell Line for Retrovirus (1 x 106 cells, Frozen)

ABP-RVC-10001 Allele Biotech 1 vial Ask for price

Gryphon Amphotropic Packaging Cell Line for Retrovirus (1 x 106 cells, Culture)

ABP-RVC-10001C Allele Biotech 1 flask Ask for price

Gryphon Ecotropic Packaging Cell Line for Retrovirus (1 x 106 cells, Frozen)

ABP-RVC-10002 Allele Biotech 1 vial Ask for price

Gryphon Ecotropic Packaging Cell Line for Retrovirus (1 x 106 cells, Culture)

ABP-RVC-10002C Allele Biotech 1 flask Ask for price

AXYGEN® GEL DOCUMENTATION SYSTEM BL

GDBL-1000 CORNING 1/pk 7632 EUR
Zatężenie wirusa w ultrawirówce dało wyższe miano wirusa przy ponad 5 × 105 jednostek  zakaźnych/ml (IFU/ml). I wreszcie, minimalne stężenie hamujące (MIC) markera selekcji puromycyną wynosiło 10 μg/ml i 7 μg/ml dla HEK293T i CC, co wskazuje na przydatność selekcji antybiotykowej dla wszystkich typów komórek. Te zachęcające dane można ekstrapolować i zastosować do innych trudnych do transfekcji komórek, takich jak różne typy komórek macierzystych lub komórki pierwotne.

Leave a Comment