Testy spektrometrii masowej ujawniają rozbieżności w profilach hamowania dla proteazy podobnej do SARS-CoV-2

Dwie proteazy SARS-CoV-2, tj. główna proteaza (M pro ) i proteaza podobna do papainy (PL pro ), które hydrolizują wirusowy łańcuch polipeptydowy, dając funkcjonalne białka niestrukturalne, są niezbędne do replikacji wirusa i stanowią chemię medyczną cele. Przedstawiamy wysokoprzepustowy test oparty na spektrometrii masowej (MS), który bezpośrednio monitoruje katalizę PL pro in vitro. Test zastosowano do zbadania wpływu zgłoszonych drobnocząsteczkowych inhibitorów PL pro i wybranych inhibitorów M pro na katalizę PL pro.
Wyniki pokazują, że niektóre, ale nie wszystkie siły działania inhibitorów PL pro różnią się znacznie od tych uzyskanych przy użyciu testów opartych na fluorescencji. Niektóre inhibitory M pro konkurujące z substratem, w szczególności PF-07321332 (nirmatrelvir), który jest w fazie badań klinicznych, nie hamują PL pro. Mniej selektywne inhibitory M pro, np. auranofina, hamują PL pro, podkreślając możliwość podwójnego hamowania PL pro/M pro. Oparte na MS testy PL pro, które są ortogonalne do powszechnie stosowanych testów opartych na fluorescencji, są przydatne w walidacji siły działania inhibitorów, zwłaszcza w przypadku inhibitorów działających w oparciu o mechanizmy niekowalencyjne.

Test włączania  do  selekcji inhibitora proteazy  HIV-1 

Wirus przez cały czas zagraża naszemu życiu i zdrowiu. Wśród nich od czasu odkrycia HIV spowodował miliony zgonów. Badania nad selekcją inhibitorów wirusowych stały się pilną potrzebą. Opracowano niezawodny test włączania do selekcji inhibitora proteazy HIV-1 (HIV-1 PR). Test wykonalności wykrywania proteazy został zademonstrowany na podstawie transferu energii rezonansu fluorescencyjnego między tlenkiem grafenu a peptydami modyfikowanymi barwnikiem. Poza szybkim i czułym wykrywaniem HIV-1 PR, zmierzono również parametry kinetyczne enzymu. Co najważniejsze, test ten zastosowano do rozróżnienia skuteczności inhibitora proteazy i wyboru nieznanego inhibitora.

Nowy  test  do oznaczania  proteazy PreScission  metodą elektroforezy kapilarnej

Wykrycie aktywności proteazy w organizmie odgrywa istotną rolę we wczesnej diagnostyce chorób. Jednak enzymy nieuchronnie wchodzą w kontakt z różnymi złożonymi płynami biologicznymi w organizmie podczas przepływu, co znacznie zwiększa trudność wykrywania. Dlatego wykrywanie proteazy in vivo wiąże się z dużymi wyzwaniami. W niniejszym dokumencie opisujemy nowy test do wykrywania proteazy przy użyciu elektroforezy kapilarnej wewnątrz kapilary z półkolistymi zagięciami. Najpierw zaprojektowaliśmy substrat peptydowy, a następnie peptyd został samozłożony z kropkami kwantowymi, aby utworzyć substrat peptydowy QDs.
Kapilara została wygięta do półkolistych zwojów i służyła jako mikroreaktor umożliwiający reakcję w niej proteazy i substratu. Ze względu na różną prędkość elektroforetyczną, proteazę i substrat zmieszano wewnątrz zgiętej kapilary z kolejnymi nastrzykami, a cięcie substratu można było wykryć za pomocą elektroforezy kapilarnej połączonej z technologią transferu energii rezonansowej Förstera. Ten nowatorski test znacznie rozszerzy wykrywanie aktywności enzymów in vivo.

Walidacja i unieważnienie głównych  inhibitorów proteazy SARS-CoV-2 przy użyciu testów  Flip-GFP i  Protease -Glo lucyferase 

Główna proteaza SARS-CoV-2 (M pro ) jest jednym z najszerzej wykorzystywanych celów leków dla COVID-19. Strukturalnie odmienne związki zostały opisane jako  inhibitory Mpro, co rodzi pytanie o ich specyficzność docelową Aby wyjaśnić specyficzność celu i zaangażowanie celu komórkowego zastrzeganych inhibitorów Mpro  , systematycznie scharakteryzowaliśmy ich mechanizm działania za pomocą bezkomórkowego testu FRET, testu wiązania z przesunięciem termicznym, testu lizatu komórkowego Proteazy-Glo lucyferazy i testu oparty na komórkach test FlipGFP. Łącznie nasze wyniki wykazały, że większość M pro inhibitory zidentyfikowane podczas ponownego użycia leków, w tym ebselen, karmofur, disulfiram i shikonin, są rozwiązłymi inhibitorami cysteiny, które nie są specyficzne dla M pro , podczas gdy chlorochina, oksytetracyklina, montelukast, kandesartan i dipirydamol nie hamują M pro  w żadnym z testowanych testów. Ogólnie rzecz biorąc, nasze badanie podkreśla potrzebę rygorystycznej walidacji trafień na wczesnym etapie odkrywania leków.
PDQ Protease Assay, 48 assays
PDQ Protease Assay, 48 assays

Testy in silico  i  in  vitro  ujawniają potencjalne inhibitory 3CL  pro –  main  proteazy  SARS-CoV-2

Pandemia COVID-19, wywołana przez nowy koronawirus zespołu ostrej ostrej niewydolności oddechowej 2 (SARS-CoV-2), nie wykazuje żadnych oznak spowolnienia, nawet po trwających staraniach o szczepienia. Zagrożenia związane z nowymi szczepami są niepokojące, ponieważ niektóre z nich są bardziej zakaźne niż oryginalne. Dlatego pilnie potrzebne jest leczenie przeciw chorobie. Tutaj używamy bazy danych DrugBank do przeszukiwania potencjalnych inhibitorów przeciw głównej proteazie 3CL pro  SARS-CoV-2. Zamiast korzystać z tradycyjnego podejścia polegającego na obliczeniowym skriningu przez dokowanie, opracowaliśmy regresor grzbietu jądra (wykorzystując część danych z dokowania) do przewidywania energii wiązania ligandów.
Wykorzystaliśmy ten model do przeszukania bazy danych DrugBank i krótkiej listy dwóch głównych kandydatów (bromokryptyna i avoralstat) do  badania  enzymatycznego in vitro . Nasze wyniki pokazują, że aktywność enzymatyczna 3CL pro  w obecności 100  μM stężenia bromokryptyny i avoralstatu wynosi odpowiednio 9,9% i 15,9% Co godne uwagi , bromokryptyna wykazywała submikromolarne IC50 130  nM (0,13  μM ). Avoralstat wykazał IC50 wynoszące  2,16  μM. Ponadto, interakcje obu leków z 3CL pro zostały  przeanalizowane przy użyciu symulacji dynamiki molekularnej 100 ns. Wyniki wskazują, że oba ligandy są stabilne w kieszeni wiążącej 3CL pro chwytnik. Ponadto analiza MM-PBSA wykazała, że ​​bromokryptyna (-29,37 kcal/mol) ma niższą energię swobodną wiązania w porównaniu z avoralstatem (-6,91 kcal/mol). Ponadto analiza wiązań wodorowych wykazała również, że bromokryptyna oddziałuje z dwiema resztami katalitycznymi, His41  i Cys145 , częściej niż avoralstat. Przekazał Ramaswamy H. Sarma.

Test  aktywności  proteazy  w jelitach muchy

Jelito jest centralnym narządem niezbędnym do trawienia pokarmu, wchłaniania składników odżywczych oraz do walki z agresorami przyjmowanymi wraz z pokarmem. Upośledzenie fizjologii jelit w następstwie uszkodzenia błony śluzowej wpływa na jego zdolności trawienne, co w konsekwencji wpłynie na wzrost, samopoczucie, a nawet przeżycie osobnika. Stąd ocena funkcji jelit obejmuje m.in. monitorowanie jego integralności, odnowę komórkową, jego obronę immunologiczną, produkcję hormonów enteroendokrynnych oraz jego zdolności trawienne. W tym miejscu szczegółowo opisujemy, jak ocenić aktywność proteaz wydzielanych w świetle jelita dorosłego Drosophila melanogastermuchy. Ta metoda może być również stosowana do jelit larwalnych. Niniejszy protokół jest dostosowany i ulepszony z protokołu Sigma-Aldrich zaproponowanego w „zestawie do wykrywania fluorescencji proteazy” (kod produktu PF0100).

Test  rozszczepiania histonów H3  in vitro dla proteazy  H3 drożdży i wątroby drobiowej 

Białka histonowe są poddawane szerokiej gamie odwracalnych i nieodwracalnych modyfikacji potranslacyjnych (PTM) (Bannister i Kouzarides, 2011; Azad i Tomar, 2014). Wiadomo, że PTM na histonach regulują strukturę i funkcję chromatyny. Histony są nieodwracalnie modyfikowane przez proteolityczne obcinanie ich domen ogonowych .

MINI TUBE, 8 STRIP, POLYPROPYLENE, 1.1 ML, CLEAR, NONSTERILE, BULK

MTS-11-8-C CORNING 120/pk 168 EUR

Mini Tube 8 Strip Pp 1.1 mL Clear Racked Nonsterile Bulk

MTS-11-8-C-R Scientific Laboratory Supplies PK600 387.6 EUR

Goat anti-Mouse, 1 x 8 Strip Well, Clear Coated 96 Well Plate, 1EA

X012-1EA Arbor Assays 1EA 130.8 EUR

MINI TUBE, 8 STRIP, POLYPROPYLENE, 1.1 ML, CLEAR, RACKED, STERILE, BULK

MTS-11-8-C-R-S CORNING 120/pk 397.2 EUR

8 Strip PCR Tubes Clear-600 Str

PCR1000 Scientific Laboratory Supplies PK600 134.52 EUR

0,1ML THIN WALL TUBES 8 PER STRIP. CLEAR

PCR-0108-LP-C CORNING 125/pk 724.8 EUR

0.2ML THIN WALL TUBES 8 PER STRIP. CLEAR

PCR-0208-C CORNING 125/pk 724.8 EUR

0.2ML THIN WALL TUBES 8 PER STRIP. CLEAR

PCR-0208-C-100 CORNING 100/pk 106.8 EUR

Low P PCR Strip Of 8 Tubes Clear

PCR1086 Scientific Laboratory Supplies PK120 107.16 EUR

Low P PCR Strip Of 8 Tube Clear

PCR1090 Scientific Laboratory Supplies PK120 119.7 EUR

8-Strip Ultra Clear Caps, 120 Strips of 8 Caps

GP407 GenDepot 960 caps 148.8 EUR

0,1ML THIN WALL TUBES 8 PER STRIP. CLEAR & REAL TIME STRIP CAPS

PCR-0108-LP-RT-C CORNING 125/pk 850.8 EUR

0.2ml Thin Wall Clear PCR Strip Tubes and Clear Flat 8-Strip Caps with writing surface

PCR-0208-FCP-C Scientific Laboratory Supplies PK125 144.78 EUR

0.2ML THIN WALL CLEAR PCR STRIP TUBES AND CLEAR STRIP CAPS.

PCR-0208-CP-C CORNING 125/pk 777.6 EUR

0.2ML THIN WALL CLEAR PCR STRIP TUBES AND CLEAR STRIP CAPS.

PCR-0208-CP-C-100 CORNING 100/pk 133.2 EUR

0.1ml qPCR 8-Strip (With SEPARATE Optical Strip Caps), Natural/Clear, 120/pk

P3801-Q MTC Bio 120/pack 157.2 EUR

0.2ml qPCR 8-Strip (With SEPARATE Optical Strip Caps), Natural/Clear, 120/pk

P3802-Q MTC Bio 120/pack 157.2 EUR

0.2ML THIN WALL TUBE CAPS 8 PER STRIP. CLEAR

PCR-02CP-C CORNING 125/pk 174 EUR

0.2ML THIN WALL TUBE CAPS 8 PER STRIP. CLEAR

PCR-02CP-C-100 CORNING 100/pk 56.4 EUR

Vari-Strip Clear Pre-Loaded

PCR1074 Scientific Laboratory Supplies PK50 397.86 EUR

96 well plates - 12x8 Well Breakable Strips on single well holding frame

MG0STF-SA5-200 Biomat 10 plates(2X5 plates in a transparent bag) 262.8 EUR

96 well plates - 12x8 Well Breakable Strips on single well holding frame

MG0STF-SA5-200-W Biomat 10 plates(2X5 plates in a transparent bag) 296.82 EUR

96 well plates - 12x8 Well Breakable Strips on single well holding frame

MG15F-BIO Biomat 10 plates(2X5 plates in a transparent bag) 217.44 EUR

96 well plates - 12x8 Well Breakable Strips on single well holding frame

MG15F-BIO-W Biomat 10 plates(2X5 plates in a transparent bag) 285.48 EUR

96 well plates - 12x8 Well Breakable Strips on single well holding frame

MGB0STF2-SA5-200 Biomat 10 plates(2X5 plates in a transparent bag) 265.07 EUR

96 well plates - 12x8 Well Breakable Strips on single well holding frame

MGB0STF2-SA5-200-W Biomat 10 plates(2X5 plates in a transparent bag) 299.09 EUR

96 well plates - 12x8 Well Breakable Strips on single well holding frame

MGB15F2-BIO Biomat 10 plates(2X5 plates in a transparent bag) 219.71 EUR

96 well plates - 12x8 Well Breakable Strips on single well holding frame

MGB15F2-BIO-W Biomat 10 plates(2X5 plates in a transparent bag) 287.75 EUR

96 well plates - 12x8 Well Breakable Strips on single well holding frame

MGW0STF-SA5-200 Biomat 10 plates(2X5 plates in a transparent bag) 265.07 EUR

96 well plates - 12x8 Well Breakable Strips on single well holding frame

MGW0STF-SA5-200-W Biomat 10 plates(2X5 plates in a transparent bag) 299.09 EUR

96 well plates - 12x8 Well Breakable Strips on single well holding frame

MGW15F-BIO Biomat 10 plates(2X5 plates in a transparent bag) 219.71 EUR

96 well plates - 12x8 Well Breakable Strips on single well holding frame

MGW15F-BIO-W Biomat 10 plates(2X5 plates in a transparent bag) 287.75 EUR

CAP FOR MINI TUBE, 8 STRIP, POLYPROPYLENE, CLEAR, NONSTERILE, BULK

MTS-8CP-C CORNING 120/pk 120 EUR

CAP FOR MINI TUBE, 8 STRIP, POLYPROPYLENE, CLEAR, STERILE, BULK

MTS-8CP-C-S CORNING 120/pk 153.6 EUR

0.2ML CLEAR FLAT PCR 8-STRIP CAPS WITH WRITING SURFACE

PCR-02-FCP-C CORNING 125/pk 152.4 EUR

Strip Immunoplate, 8 well/strip, PS, white PS frame, 85.4x127.6mm, MAXIBINDING, 10/100/case

SP49207 Bio Basic 1CS, 100UNIT 377.76 EUR

Corning 96 Well Strip Ejector

2578 Scientific Laboratory Supplies PK5 77.52 EUR

96 Well MPlate Sealing Strip

CHR5886 Scientific Laboratory Supplies PK24 52.44 EUR

24 Well (3 x 8) PCR Plates, Clear

GP601 GenDepot 50 plates 273.6 EUR

48 Well (6 x 8) PCR Plates, Clear

GP602 GenDepot 50 Plates 273.6 EUR

0.2mL Clear Polypropylene PCR Tubes 8 Well Strips

6542 Scientific Laboratory Supplies PK300 595.08 EUR

8 Strip 0.2ml Tubes

PCR1126 Scientific Laboratory Supplies PK125 78.66 EUR

8 Strip 0.2ml Tubes

PCR1130 Scientific Laboratory Supplies PK125 58.94 EUR

8 Strip Domed Caps

PCR1134 Scientific Laboratory Supplies PK125 52.44 EUR

Clear 384 Well Plate

X105-1EA Arbor Assays 1EA 134.4 EUR

0.2ml PCR Strip Caps 8 Caps per strip

PCR-02CP-A Scientific Laboratory Supplies PK1250 298.68 EUR

0.2ML THIN WALL CLEAR PCR STRIP TUBES WITH INDIVIDUALLY ATTACHED DOMED STRIP CAPS, CLEAR, NONSTERILE

PCR-0208-AD-C CORNING 126/pk 900 EUR

0.2ML THIN WALL CLEAR PCR STRIP TUBES WITH INDIVIDUALLY ATTACHED FLAT STRIP CAPS, CLEAR. NONSTERILE

PCR-0208-AF-C CORNING 126/pk 900 EUR

Microplate 12x8-Well Strip High Binding

GR238002 Genorise Scientific Case of 50 526.8 EUR

Microplate 12x8-Well Strip Medium Binding

GR238003 Genorise Scientific Case of 50 330 EUR

0.2ML THIN WALL CLEAR PCR STRIP TUBES, 12 TUBES PER STRIP

PCR-0212-C CORNING 80/pk 733.2 EUR

0.1ml 8-tube PCR strip, flat cap, clear, sterile, 125 pcs/pk

210108-13pk ACTGene 181.2 EUR

0.2ml 8-tube PCR strip, flat cap, clear, sterile, 125 pcs/pk

210208-13pk ACTGene 181.2 EUR

0.1ml 8-tube PCR strip, dome cap, clear, sterile, 125 pcs/pk

220108-13pk ACTGene 181.2 EUR

0.2ml 8-tube PCR strip, dome cap, clear, sterile, 125 pcs/pk

220208-13pk ACTGene 181.2 EUR

0.2 ml 8-Strip Tubes & Optically Clear Caps, 120 Strips of 8 Tubes and Caps

GP207 GenDepot 960 tubes/caps 295.2 EUR

CAP FOR MINITUBE 8-STRIP

AXYMTS8CPC Scientific Laboratory Supplies PK600 105.34 EUR

8 Strip Flat Optical Caps

PCR1136 Scientific Laboratory Supplies PK125 52.44 EUR

8 Strip 0.2ml Tubes Flat

PCR1138 Scientific Laboratory Supplies PK125 78.66 EUR

Brand pcr Caps strip 8

BR781413-300EA Scientific Laboratory Supplies PK300 115.14 EUR

1730 8 SNAP-SEAL 8 OZ

1730-8 CORNING 100/pk 88.8 EUR

384 WELL CLEAR RIGI PLATE PCR MICROPLATE. CLEAR

PCR-384-RGD-C CORNING 20/pk 550.8 EUR

0.2ML THIN WALL CLEAR PCR FLAT STRIP CAPS. 12 CAPS PER STRIP

PCR-12-FCP-C CORNING 80/pk 184.8 EUR

24 WELL PCR MICROPLATE. CLEAR

PCR-24-C CORNING 10/pk 87.6 EUR

32 WELL PCR MICROPLATE. CLEAR

PCR-32-C CORNING 10/pk 105.6 EUR

384 WELL PCR MICROPLATE. CLEAR

PCR-384-C CORNING 10/pk 219.6 EUR

96 WELL CLEAR PCR MICROPLATE

PCR-96-C CORNING 10/pk 174 EUR

24 Well Clear Plate fibronectin

356241 Scientific Laboratory Supplies PK10 400.14 EUR

0.2ML THIN WALL CLEAR PCR STRIP TUBES AND FLAT STRIP CAPS. 12 TUBES/CAPS PER STRIP

PCR-0212-FCP-C CORNING 80/pk 777.6 EUR

0.2 ml 8-Strip White Tubes & Optically Clear Caps, 120 Strips of 8 Tubes and Caps

GP208 GenDepot 960 tubes/caps 295.2 EUR

Axygen 0.2ml MaxyClear domed cap PCR strip 8 per strip

AXY2024 Scientific Laboratory Supplies PK125 28.96 EUR

0.2ML CLEAR STRIP CAPS FOR REAL TIME PCR

PCR-2CP-RT-C CORNING 125/pk 267.6 EUR

Greiner PCR Strip - 8 Tubes. Natural

G673210 Scientific Laboratory Supplies PK125 125.4 EUR

Strip Of 8 200mu PCR Tubes

PCR1180 Scientific Laboratory Supplies PK120 68.4 EUR

Strip Of 8 100mu PCR Tubes

PCR1182 Scientific Laboratory Supplies PK120 74.1 EUR

Strip Of 8 200mu PCR Tubes

PCR1184 Scientific Laboratory Supplies PK120 62.7 EUR

AXYGEN® 8-WELL COMB FOR USE WITH 10 CM GEL BOX, 1.0 MM THICKNESS

HGB10-8-1 CORNING 1/pk 70.8 EUR

AXYGEN® 8-WELL COMB FOR USE WITH 15 CM GEL BOX, 1.0 MM THICKNESS

HGB15-8-1 CORNING 1/pk 82.8 EUR

AXYGEN® 8-WELL COMB FOR USE WITH 15 CM GEL BOX, 1.5 MM THICKNESS

HGB15-8-15 CORNING 1/pk 82.8 EUR

AXYGEN® 8-WELL COMB FOR USE WITH 7 CM GEL BOX, 0.75 MM THICKNESS

HGB7-8-075 CORNING 1/pk 64.8 EUR

AXYGEN® 8-WELL COMB FOR USE WITH 7 CM GEL BOX, 1.0 MM THICKNESS

HGB7-8-1 CORNING 1/pk 64.8 EUR

Axygen 0.2ml MaxyClear thin walled PCR tube strip 8 per strip

AXY2014 Scientific Laboratory Supplies PK125 136.8 EUR

Clear Coated 96 Well Plate, 1EA

C107-1EA Arbor Assays 1EA 226.8 EUR

24 Well Clear Plate Collagen I

356271 Scientific Laboratory Supplies PK10 367.08 EUR

Nunc 384 Well Plate Clear MaxiSorp

464718 Scientific Laboratory Supplies PK30 345.42 EUR

96 Well MTP U Shaped Clear

PCR0226 Scientific Laboratory Supplies PK100 150.48 EUR

96 Well PCR Plate Clear Wells

PCR0972 Scientific Laboratory Supplies PK50 201.78 EUR

Individual Reaction Mix 8

G065-8 ABM 200 reactions 200.4 EUR

8-Strip Flat Caps, 120 Strips of 8 Caps

GP401 GenDepot 960 caps 133.2 EUR

8-Strip Flat Caps, 250 Strips of 8 Caps

GP402 GenDepot 2,000 caps 165.6 EUR

8-Strip Domed Caps, 120 Strips of 8 Caps

GP403 GenDepot 960 caps 133.2 EUR

8-Strip Domed Caps, 250 Strips of 8 Caps

GP404 GenDepot 2,000 caps 165.6 EUR

8-Strip Domed Caps, 300 Strips of 8 Caps

GP405 GenDepot 2,400 caps 230.4 EUR

8-Strip Domed Caps, 500 Strips of 8 Caps

GP406 GenDepot 4,000 caps 273.6 EUR

Microbiol clear semi skirted clear PCR plate 96 well 10pcs

E0030129326 Scientific Laboratory Supplies EACH 82.08 EUR

Human IL-8 Recombinant Protein

R00423-8 BosterBio 5ug/vial 310.8 EUR

0.1ml qPCR 8-Strip (With SEPARATE Optical Strip Caps) FROSTED, 120/pk

P3801-QF MTC Bio 120/pack 157.2 EUR

0.1ml qPCR 8-Strip (With SEPARATE Optical Strip Caps), WHITE 120/pk

P3801-QW MTC Bio 120/pack 162.06 EUR

0.2ml qPCR 8-Strip (With SEPARATE Optical Strip Caps), WHITE, 120/pk

P3802-QW MTC Bio 120/pack 162.06 EUR

0,1ML THIN WALL TUBES 8 PER STRIP. WHITE & REAL TIME STRIP CAPS

PCR-0108-LP-RT-W CORNING 125/pk 924 EUR
Proteolityczne obcinanie ogonków histonowych nieustannie wzbudza zainteresowanie badaczy zajmujących się biologią chromatyny. Możemy podsumować obcinanie H3 wykonując   test rozszczepiania H3 in vitro . Tutaj przedstawiamy szczegółowy protokół wykonania   testu rozszczepiania H3 in vitro .

Dodaj komentarz